三個(gè)多倍體萱草品種的組培快繁

鄒巖梅 李桂云 陳曉流

摘要：以多倍體萱草三個(gè)品種（代號(hào)分別為28、41、42）的花莖及幼蕾為外植體進(jìn)行組培研究，結(jié)果表明，花莖的愈傷誘導(dǎo)及其相應(yīng)的芽分化明顯好于花蕾，花莖做外植體更適宜;以MS+（2.0～2.5） mg/L BA+（0.20～0.25） mg/L NAA培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)效果較好，三個(gè)品種中以41號(hào)愈傷形成早且量大，28號(hào)次之，42號(hào)愈傷出現(xiàn)較晚且量較少。在誘導(dǎo)芽分化時(shí)，41號(hào)和28號(hào)在MS+2.5 mg/L BA+（0.20～0.25） mg/L NAA培養(yǎng)基上芽分化數(shù)量多，41號(hào)最易芽分化，28號(hào)次之;42號(hào)需要多代的芽誘導(dǎo)馴化培養(yǎng)才分化出芽，在MS+（2.5～3.0） mg/L BA+（0.25～0.30） mg/L NAA培養(yǎng)基上分化數(shù)量較多，但分化率低于41號(hào)和28號(hào)。三個(gè)品種在MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA培養(yǎng)基上的增殖效果較好，在1/2MS+0.10 mg/L NAA中適宜生根培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：多倍體萱草;離體培養(yǎng);快速繁殖

中圖分類號(hào)：S682.1+90.4+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）02-0023-05

Tissue Culture and Rapid Propagation of Three

Cultivars of Polyploid Hemerocallis fulva

Zou Yanmei?Li Guiyun?Chen Xiaoliu

（1. College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University/ State Key Laboratory of

Crop Biology，Taian 271018，China; ?2. Biotechnology Engineering Department， Taishan Polytenic， Taian 271000，China）

AbstractThree cultivars of polyploid Hemerocallis fulva（cultivar number 28， 41 and 42） were selected for tissue culture by using their floral axis and flower buds as explants. The results were as follows： the callus produced from floral axis were much more and the buds were more easily differentiated compared with flower bud， so the floral axis was preferably as explants. The culture media of MS+（2.0～2.5） mg/L BA+（0.20～0.25） mg/L NAA were better for callus induction. The callus induced from cultivar 41 was the earliest and the most followed by the cultivar 28， while that from the cultivar 42 was the latest and least. In inducing buds， the media of MS+2.5 mg/L BA+（0.20～0.25） mg/L NAA induced much more buds from the cultivars 41 and 28，in which， it was more easily to induce buds from the cultivar 41 compared with 28. It needed for many generations of domestication culture to induce buds for the cultivar 4?and the media of MS+（2.5～3.0） mg/L BA+（0.25～0.30） ?mg/L NAA was optimal， but its inducing rate was lower than that of the cultivars 41 and 28. The medium of MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA was better for multiplication culture， and the medium 1/2MS+0.10 mg/L NAA was appropriate for rooting culture.

KeywordsPolyploid Hemerocallis fulva; In vitro culture; Rapid propagation

大花萱草又叫多倍體萱草（Hemerocallis fulva var. flore pleno），為百合科（Liliacea）萱草屬（Hemerocallis L.）多年生宿根草本 [1]。其抗旱能力強(qiáng)，耐高溫，抗低寒，適應(yīng)溫度范圍廣，在我國(guó)從南到北均可種植?？共⌒詮?qiáng)，對(duì)土壤的適應(yīng)性廣，除過(guò)酸、過(guò)堿、過(guò)沙、過(guò)粘的土壤外一般都能栽培，pH值以6.5～7.5為好。萱草對(duì)堿性土具有特別的耐性，是油田及灘涂地帶不可多得的綠化材料?？捎脕?lái)布置各式花壇、馬路隔離帶、疏林草坡等;亦可利用其矮生特性做地被植物[2]。

萱草的繁殖方法為分株繁殖，分割萱草叢塊是最常用的繁殖方法，該方法操作簡(jiǎn)單，植株容易存活，長(zhǎng)勢(shì)比較一致。分株多在春季萌芽前或秋季落葉后進(jìn)行，春季分株移栽，當(dāng)年即可抽薹開花;秋季分株移栽，翌年才能抽薹開花。但其自然分蘗繁殖的速度較慢，遠(yuǎn)不能滿足商品化生產(chǎn)的需要。而利用組培快繁技術(shù)，可以極大地提高萱草的繁殖數(shù)量，加快繁殖速度，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。目前已有一些關(guān)于萱草組培快繁的報(bào)道，對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等過(guò)程進(jìn)行研究[3-6]?。分析以往的研究發(fā)現(xiàn)，不同萱草品種間基因型的差異較大，其組培快繁的結(jié)果不盡相同。本試驗(yàn)對(duì)從國(guó)外引進(jìn)的三個(gè)多倍體萱草品種進(jìn)行組培研究，為擴(kuò)大其增殖倍數(shù)、快速育苗提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2016年6月末至7月初，于山東泰安的多倍體萱草資源圃中選取三個(gè)品種，其代號(hào)分別為28、41、42，花色分別為玫紅色、金黃色、重瓣深紫色。取整個(gè)花序，分別切取幼嫩的花蕾及花蕾下方約5 cm的花莖，流水沖洗1 h后，把花莖切成約0.5 cm的莖段，花蕾橫切后保留花蕾下半部。在超凈工作臺(tái)上，把處理好的外植體材料在75%酒精中浸泡30 s后，用無(wú)菌水沖洗;再轉(zhuǎn)入3%的NaClO中浸泡10 min，用無(wú)菌水沖洗5遍，以備接種。

1.2愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種外植體接種40瓶，每瓶1份材料，培養(yǎng)時(shí)間為40 d，期間觀察愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀況。培養(yǎng)基分別為：MS+1.0 mg/L BA+0.10 mg/L NAA、 MS+1.5 mg/L BA+0.10 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L BA+0.20 mg/L NAA 和MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA，均添加30 g/L蔗糖和6 g/L瓊脂，調(diào)pH值為5.8。培養(yǎng)條件：溫度25℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，每天光照16 h。

1.3芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將誘導(dǎo)的愈傷組織分別轉(zhuǎn)接到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基分別為：MS+2.0 mg/L BA+0.20 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L BA+0.25 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L BA+0.30 mg/L NAA、MS+2.5 mg/L BA+0.20 mg/L NAA、MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA、MS+2.5 mg/L BA+0.30 mg/L NAA、MS+3.0 mg/L BA+0.30 mg/L NAA，均添加30 g /L蔗糖和6 g/L瓊脂，調(diào)pH值為5.8。培養(yǎng)條件同上。

1.4繼代增殖培養(yǎng)

將芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好、健壯的嫩芽切下轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)基分別為：MS+2.0 mg/L BA+0.20 mg/L NAA、MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA及MS+3.0 mg/L BA+0.30 mg/L NAA，均添加30 g/L蔗糖和6 g/L瓊脂，調(diào)pH值為5.8。培養(yǎng)條件同上。

增殖倍數(shù)=繼代后芽苗數(shù)量/繼代前芽苗數(shù)量

1.5生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)中生長(zhǎng)至2～3 cm高的壯苗剪下，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，觀察生根狀況。生根培養(yǎng)基分別為： 1/2MS+0.1 mg/L NAA 和1/2MS+0.15 mg/L NAA，均附加 20 g/L 蔗糖和5 g/L瓊脂，調(diào)整pH為5.8。培養(yǎng)條件同上。

生根率（%）=生根的組培苗數(shù)量/接種的芽苗數(shù)量×100

2結(jié)果與分析

2.1愈傷組織誘導(dǎo)

將三個(gè)多倍體萱草品種的外植體接種到四種培養(yǎng)基上后，保持鮮綠色、無(wú)褐變，20 d后有黃綠色的愈傷組織長(zhǎng)出，表現(xiàn)為花莖外植體都能誘導(dǎo)出愈傷且愈傷出現(xiàn)時(shí)間早、生長(zhǎng)量大;而花蕾外植體雖可以誘導(dǎo)出愈傷，但愈傷出現(xiàn)的時(shí)間晚、生長(zhǎng)量很小。

花莖在MS+1.0 mg/L BA+0.10 mg/L NAA和MS+1.5 mg/L BA+0.10 mg/L NAA培養(yǎng)基上的愈傷生長(zhǎng)量少，在MS+2.0 mg/L BA+0.20 mg/L NAA培養(yǎng)基上愈傷生長(zhǎng)速度較快且量較多;MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA 培養(yǎng)基上愈傷生長(zhǎng)速度快、量較大，是愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。培養(yǎng)40 d后三個(gè)基因型在MS+2.0 mg/L BA+0.20 mg/L NAA 上的表現(xiàn)差異明顯，41號(hào)愈傷最早分化且生長(zhǎng)量大，28號(hào)愈傷分化時(shí)間略晚且生長(zhǎng)量居中，42號(hào)則愈傷分化晚且生長(zhǎng)量相對(duì)較少（表1）。

在初代培養(yǎng)的40 d內(nèi)，三個(gè)品種的愈傷中均未見芽的分化。

2.2芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

初代培養(yǎng)40 d后，選取各品種花莖和花蕾誘導(dǎo)出的較大體積的愈傷組織，切成小塊，轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，觀察愈傷的生長(zhǎng)及再分化情況。結(jié)果表明，花莖的愈傷組織生長(zhǎng)量大且芽分化率高;而花蕾的愈傷組織生長(zhǎng)量少，芽分化率很低。

調(diào)查花莖愈傷的芽誘導(dǎo)分化，結(jié)果（表2）表明，在MS+（2.0～2.5） mg/L BA+（0.20～0.25） mg/L NAA的培養(yǎng)基上，愈傷組織生長(zhǎng)量較多，黃綠色且緊實(shí); 41號(hào)和28號(hào)均有較多芽的分化，尤以在MS+2.5 mg/L BA+（0.20～0.25） mg/L NAA培養(yǎng)基上分化數(shù)量多、分化苗長(zhǎng)勢(shì)健壯、愈傷質(zhì)量好;在MS+3.0 mg/L BA+0.30 mg/L NAA培養(yǎng)基上，41號(hào)和28號(hào)雖然芽分化快、數(shù)量較多，但分化苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，且愈傷質(zhì)量不佳，不利于后續(xù)利用愈傷組織繼續(xù)誘導(dǎo)分化芽。

在各種培養(yǎng)基中，41號(hào)都非常容易分化且分化數(shù)量最多;28號(hào)較易分化，分化數(shù)量居中。42號(hào)最難分化，在各分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d后均沒(méi)有分化出芽，直至連續(xù)培養(yǎng)10個(gè)周期、將近11個(gè)月后，才在MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA和MS+3.0 mg/L BA+0.30 mg/L NAA培養(yǎng)基上分化出芽，且以后者較好，表現(xiàn)為芽健壯且愈傷組織較為緊密，但其分化芽的數(shù)量比41號(hào)和28號(hào)的少。

上述結(jié)果表明，多倍體萱草不同基因型之間組織培養(yǎng)的難易程度差別較大。從資源圃里調(diào)查發(fā)現(xiàn)，41號(hào)在田間的自然分蘗數(shù)量最多，28號(hào)次之，而42號(hào)則很少分蘗?？梢?，對(duì)于自然分蘗量大的品種，其組培也相對(duì)容易;反之，自然分蘗很少的品種，其愈傷則需要在培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的多代馴化培養(yǎng)才可以分化成芽，增加了組培成功的難度。

2.3增殖培養(yǎng)

將分化出28、41、42號(hào)的芽叢切成單獨(dú)的芽，接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)、形成芽叢，實(shí)現(xiàn)快繁增殖。培養(yǎng)40 d時(shí)統(tǒng)計(jì)各基因型的增殖表現(xiàn)，結(jié)果（表3）表明，基因型不同，其增殖能力差別較大。

41號(hào)在各培養(yǎng)基上增殖系數(shù)都最大，容易增殖。在MS+（2.0～2.5） mg/L BA+（0.20～0.25） mg/L NAA培養(yǎng)基上分化系數(shù)適中，分化的芽粗壯、質(zhì)量好;但在激素水平高的MS+（2.5～3.0） mg/L BA+0.30 mg/L NAA培養(yǎng)基上芽分化過(guò)快而導(dǎo)致分化的芽長(zhǎng)勢(shì)稍弱、玻璃化比率較大、愈傷松散伴有褐化。綜合考慮，41號(hào)在MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA上增殖效果最佳。

28號(hào)在各培養(yǎng)基上增殖系數(shù)居中，分化芽長(zhǎng)勢(shì)較為粗壯。在 MS+2.5 mg/L BA+0.25 mg/L NAA 培養(yǎng)基上表現(xiàn)較好，分化率較高且分化苗較壯;在MS+3.0 mg/L BA+0.30 mg/L NAA培養(yǎng)基上雖然增殖系數(shù)提高，但分化苗生長(zhǎng)勢(shì)偏弱、略有玻璃化且愈傷太松散、易褐化。

相對(duì)于28號(hào)和41號(hào)，42號(hào)增殖倍數(shù)較低，愈傷生長(zhǎng)也較慢。綜合比較，在激素水平都較高的MS+3.0 mg/L BA + 0.30 mg/L NAA培養(yǎng)基上，分化系數(shù)高、苗粗壯、愈傷量中等、質(zhì)量佳。

從三個(gè)基因型的增殖表現(xiàn)看出，在單芽分化出芽叢的同時(shí)都有愈傷組織的生長(zhǎng)，將生長(zhǎng)的愈傷組織單獨(dú)剝離出來(lái)放到芽分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一個(gè)周期后仍可誘導(dǎo)分化出較多數(shù)量的芽。因此，對(duì)于多倍體萱草，可以通過(guò)對(duì)愈傷進(jìn)行芽誘導(dǎo)和芽增殖的雙重方式達(dá)到增殖培養(yǎng)的目的。

2.4生根培養(yǎng)

將三個(gè)基因型的壯苗切下，接種到1/2MS+0.10 mg/L NAA 和1/2MS+0.15 mg/L NAA兩種生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

在1/2MS+0.10 mg/L NAA的培養(yǎng)基上（表4），41號(hào)最先生根，培養(yǎng)7 d生根率即達(dá)90%，培養(yǎng)10 d后生根率100%，至第15 d，根長(zhǎng)5～31 mm，單株根數(shù)5～12條，最粗根直徑達(dá)1.0 mm。28號(hào)培養(yǎng)10 d生根率僅30%，培養(yǎng)15 d后生根率達(dá)到90%，至20 d時(shí)生根率達(dá)94%，單株根數(shù)3～12條，根長(zhǎng)5～30 mm，最粗根直徑1.2 mm;繼續(xù)培養(yǎng)至第25 d生根率達(dá)到100%。42號(hào)生根相對(duì)較晚，培養(yǎng)15 d生根率僅20%，25 d時(shí)生根率80%，單株根數(shù)2～8條，根長(zhǎng)3～20 mm，最粗根直徑0.8 mm;繼續(xù)培養(yǎng)至30 d時(shí)生根率達(dá)100%。

而在1/2MS+0.15 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上，雖然NAA的濃度增加了0.05 mg/L，但三種基因型生根較為遜色，表現(xiàn)為苗基部先有較多愈傷生長(zhǎng)，生根時(shí)間延遲。培養(yǎng)30 d時(shí)，根系數(shù)量變化不大，其長(zhǎng)度和粗度與1/2MS+0.10 mg/L NAA培養(yǎng)基的相差不大?？梢姡?/2MS+0.10 mg/L NAA更適宜多倍體萱草的生根培養(yǎng)。

三個(gè)基因型間比較，開始生根的時(shí)間不同，41號(hào)最早，42號(hào)最晚，但最終都達(dá)到100%的生根率，且總體根系數(shù)量多、質(zhì)量好，經(jīng)練苗后移栽成活率均達(dá)90%以上。

3討論與結(jié)論

3.1愈傷組織誘導(dǎo)

所用外植體不同，萱草的愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。姜鳳英等[7]對(duì)多倍體萱草‘金娃娃的研究表明，外植體誘導(dǎo)愈傷的效果，花蕾好于花莖，以花瓣最差;尹立輝等[2]的研究則表明多倍體萱草愈傷誘導(dǎo)以幼嫩花蕾和花瓣為外植體最為適宜，花莖最差;柏文琴等[1]報(bào)道，大花萱草花莖的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，花瓣難以誘導(dǎo)愈傷，花托和子房愈傷組織誘導(dǎo)率較低，并且以花托和子房誘導(dǎo)的愈傷組織在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上干枯死亡;彭廣霖等[4]報(bào)道用幼嫩花梗進(jìn)行大花萱草快繁取得良好效果。本研究也發(fā)現(xiàn)，以多倍體萱草花莖為外植體更容易誘導(dǎo)出愈傷和芽，而以花蕾為外植體雖也可誘導(dǎo)出愈傷，但愈傷出現(xiàn)的時(shí)間晚、量少，且芽分化率很低，不適宜用作多倍體萱草愈傷誘導(dǎo)的外植體。

3.2芽分化

多倍體萱草不同基因型的組培難易程度差別較大，41號(hào)、28號(hào)品種的愈傷組織容易分化出芽且數(shù)量多，而42號(hào)品種的愈傷組織需要經(jīng)歷連續(xù)多代的培養(yǎng)馴化才可以分化出芽。因此，當(dāng)某些基因型萱草初代或繼代培養(yǎng)不成功時(shí)，可以嘗試進(jìn)行連續(xù)多代的馴化培養(yǎng)以誘導(dǎo)出芽，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)組培快繁。

3.3增殖培養(yǎng)

尹立輝等[2]研究報(bào)道多倍體萱草的增殖系數(shù)達(dá)5.8，而本研究中三個(gè)基因型多倍體萱草的增殖系數(shù)在4.3～8.0之間。本研究發(fā)現(xiàn)，多倍體萱草在芽增殖培養(yǎng)形成芽叢的同時(shí)，產(chǎn)生較多愈傷組織，因此，在后續(xù)的連續(xù)多代增殖培養(yǎng)時(shí)，一方面可以對(duì)芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)形成芽叢，另一方面可以利用不斷形成的愈傷組織分化形成更多的芽，兩方面相結(jié)合共同達(dá)到快繁的目的。

3.4生根培養(yǎng)

在已有的報(bào)道中，多倍體萱草生根的生長(zhǎng)素濃度都較低，如尹立輝等[2]報(bào)道在MS+0.04 mg/L NAA培養(yǎng)基上可達(dá)100%的生根率;袁愛民等[5]報(bào)道，多倍體萱草在1/2 MS+0.02 mg/L NAA培養(yǎng)基上生根較好;多倍體萱草‘金娃娃在1/2MS+0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上生根率達(dá)96%[7]。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，三個(gè)多倍體萱草品種也表現(xiàn)為在1/2MS+0.10 mg/L NAA培養(yǎng)基上生根效果較好。但也有報(bào)道采用較高濃度的生長(zhǎng)素進(jìn)行生根培養(yǎng)，如宋雪蓮等[8]報(bào)道，多倍體萱草的5個(gè)新品種在1/2MS+（0.4～0.6） mg/L NAA上生根率可達(dá)100%。這可能與不同品種的基因型差別有關(guān)。另外，研究中發(fā)現(xiàn)生根苗在移栽時(shí)對(duì)空氣濕度的變化不敏感，移植到基質(zhì)中進(jìn)行正常管理即可實(shí)現(xiàn)很高的成活率。

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