核桃油脂合成轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王貴芳 王文茹 張淑輝 相昆 徐穎 張美勇

摘要：為研究核桃果實油脂合成與積累的分子調(diào)控機理，以核桃果實種仁cDNA為模板克隆得到油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因，其cDNA序列全長為1 230 bp，編碼409個氨基酸。通過對其結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)特性進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超級家族，具有特異的DNA結(jié)合序列，調(diào)節(jié)生物合成和代謝過程，定位于細胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子行使功能的特點。并構(gòu)建了JrWRI1超表達重組載體，為進一步研究JrWRI1在核桃果實油脂合成與積累過程中的功能奠定基礎(chǔ)，也為利用分子手段加快高油核桃新品種的選育提供參考。

關(guān)鍵詞：核桃;果實;油脂;轉(zhuǎn)錄因子;JrWRI1

中圖分類號：S664.103文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0001-06

Cloning and Bioinformatics Analysis of Transcription Factor

JrWRI1 Gene Related with Lipids Synthesis of Walnut

Wang Guifang??Wang Wenru??Zhang Shuhui??Xiang Kun??Xu Ying??Zhang Meiyong

（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2.College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

AbstractIn order to study the molecular regulation mechanism of lipids synthesis and accumulation in walnut fruits， a gene JrWRI1， the key transcription factor for lipids synthesis， was cloned from walnut seeds. The cDNA sequence of JrWRI1 was 1 230 bp encoding 409 amino acids. Through the analysis of structural and biological characteristics， it was found that the gene JrWRI1 belonged to the AP2/ERF transcription factor superfamily， which had specific DNA binding sequence， regulated the biosynthesis and metabolic process， and was located in the nucleus， so it was conformed to the characteristics of transcription factor performing functions. The over-expression recombinant vector of JrWRI1 was constructed， which laid a foundation for further study on the functions of JrWRI1 in the oil synthesis and accumulation in walnut seeds， and provided a reference for accelerating the selection and breeding of new varieties of high-oil walnut by molecular means.

KeywordsWalnut; Fruit; Lipids; Transcription factor; JrWRI1

核桃（Juglans regia L.）在我國分布范圍廣、栽培歷史悠久，在保障我國糧油安全和退耕還林方面扮演重要角色[1]。近年來，我國植物油消費量持續(xù)增長，需求缺口不斷擴大，對外依存度明顯上升，食用植物油安全問題日益突出。為增加健康優(yōu)質(zhì)食用油的供給，切實維護國家糧油安全，2014年國務(wù)院頒布《關(guān)于加快木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》，提出大力發(fā)展油茶、核桃、油用牡丹等木本油料樹種，到2020年產(chǎn)出木本食用油150萬噸左右。高含油量新品種的選育是提高食用油產(chǎn)量的重要途徑。因此，提高核桃種仁含油量、改善其內(nèi)在品質(zhì)成為核桃育種的當(dāng)務(wù)之急。與傳統(tǒng)育種方法相比，分子育種年限更短，對性狀的操作更精確[2，3]。

WRI1是模式植物油脂合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中首次被發(fā)現(xiàn)[4]，與野生型相比，突變體wri1不能正常地將葡萄糖和蔗糖轉(zhuǎn)化成脂肪酸合成的前體物質(zhì)，種子的含油量降低80%，己糖激酶、磷酸果糖激酶等幾個糖酵解酶的活性降低，且種皮表面皺縮，因此被命名為WRINKLED1（WRI1）。WRI1蛋白在N端和C端各有1個與DNA結(jié)合的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，其中AP2結(jié)構(gòu)域非常保守，是APETALA2（AP2）家族的一員[5]。在擬南芥中過表達甘藍型油菜（Brassica napus）WRI1同源基因使種子的油脂含量上升10%～40%[6]。在甘藍型油菜中過表達BnWRI1，則花期提前，種子中油脂積累提高18%～38%，葉片中提高28%～63%[7]。在單子葉植物二穗短柄草的葉片中異位表達BdWRI1使葉片中的油脂積累提高32.5倍，游離脂肪酸含量提高2倍;AtWRI1基因在擬南芥中超表達不僅使種子的含油量增加，而且引起幼苗積累三酰甘油[8]。An等[9]將AtWRI1基因在油料作物亞麻薺中超表達，得到的植株比野生型產(chǎn)油量提高了14%。可見，超表達轉(zhuǎn)錄因子WRI1編碼基因能夠提高植物種子的油脂含量。柴國華等[10]用RNAi技術(shù)干擾油菜內(nèi)源WRI1基因的表達，則降低了種子的含油量。

大量試驗證明WRI1作為模式植物油脂合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在提高植物種子含油量方面具有極高的應(yīng)用價值，但WRI1在木本油料樹種核桃果實油脂合成與積累中的作用機理仍不清楚，這極大地限制了分子育種在核桃育種上的應(yīng)用。2015年，張通[11]利用高通量數(shù)字基因表達譜技術(shù)從核桃中發(fā)現(xiàn)了WRI1基因。本研究通過克隆轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因，對其結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)功能進行分析，構(gòu)建原核重組表達載體并在大腸桿菌DH5α中高效表達，為進一步研究JrWRI1基因在核桃果實油脂合成與積累中的功能奠定基礎(chǔ)，也為利用分子手段加快高油核桃新品種的選育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2017年4月至2018年3月在山東省果樹生物技術(shù)育種重點實驗室、山東省干果育種工程技術(shù)研究中心和國家蘋果工程技術(shù)研究中心進行。

植物材料為‘香玲核桃果實，采自山東省泰安市國家核桃種質(zhì)資源圃。選取晴天上午進行采樣，采樣時間為2017年4—8月，核桃種仁總RNA提取樣品于液氮中迅速冷凍，保存于-80℃冰箱;核桃果實發(fā)育動態(tài)樣品帶回實驗室進行解剖、觀察及拍照。

1.2核桃種仁總RNA的提取及JrWRI1基因的克隆、轉(zhuǎn)化

以‘香玲核桃種仁為試材提取總RNA，采用OMEGA植物組織總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈采用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit （Perfect Real Time），參照說明書進行操作。目的基因JrWRI1的克隆參照GenBank登錄的核桃WRI1-like基因（GenBank登錄號：XP_018846238.1）的CDS序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，引物序列見表1。以上述cDNA為模板進行目的基因JrWRI1的PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5?min;94℃變性 30 s，54℃退火 70 s，72℃延伸 30 s，36個循環(huán);最后 72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，對目的基因進行回收，將目的基因與克隆表達載體pMD-19T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，目的基因菌落PCR檢測，挑取3個陽性克隆菌落進行測序。

1.3JrWRI1基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI在線BLAST（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov）工具對JrWRI1基因編碼蛋白序列進行同源序列查找，采用MEIGA軟件對WRI1同源序列進行序列比對及系統(tǒng)進化分析。運用ProtParam （http：//us.expasy.org/tools/ProtParam.html）預(yù)測JrWRI1的分子量、等電點等理化特性;通過PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/get_results？）軟件預(yù)測JrWRI1的功能及亞細胞定位。

2結(jié)果與分析

2.1核桃果實種仁油脂轉(zhuǎn)化期的確定

對‘香玲核桃果實的發(fā)育過程進行調(diào)查，解剖不同發(fā)育時期的果實（圖1），明確‘香玲核桃種仁進入油脂轉(zhuǎn)化期所需的時間（以開花后天數(shù)DPA計量）。自開花至60 DPA，果實處于快速膨大期，胚囊不斷擴大，核殼逐漸形成，但色白質(zhì)嫩，種仁逐漸形成透明半流質(zhì)狀的內(nèi)含物;花后60 DPA左右，果實處于硬核期，種殼自頂端向基部逐漸硬化，種仁內(nèi)含物質(zhì)開始積累;自60 DPA至125 DPA，果實大小基本定型，種殼逐漸骨質(zhì)化，種仁內(nèi)含物快速增加，種仁風(fēng)味由甜變香?？梢姟懔岷颂曳N仁自60 DPA左右至成熟期（125 DPA）進入內(nèi)含物填充階段，也是油脂逐漸積累的階段，屬于油脂的轉(zhuǎn)化期。

2.2JrWRI1基因克隆及序列分析

依據(jù)GenBank登錄的核桃WRI1-like基因（GenBank登錄號：XP_018846238.1）的CDS序列設(shè)計引物，以‘香玲核桃種仁cDNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)，擴增獲得轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因，其cDNA序列全長為1 230 bp（圖2），編碼409個氨基酸。將擴增得到的目的基因片段進行回收并與pMD-19T質(zhì)粒相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落送交上海生工生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank登錄的核桃WRI1-like基因的序列相比對。結(jié)果如圖3所示，三個陽性菌落目的基因序列完全一致，與核桃對照基因WRI1-like序列的相似度為99.92%，可見轉(zhuǎn)錄因子WRI1屬于非常保守的基因家族，擴增得到的JrWRI1基因全長即為目的基因。

2.3JrWRI1基因家族進化關(guān)系分析

運用NCBI網(wǎng)站BLAST工具對核桃、桃、山杏、甜櫻桃、胡楊、大豆、芝麻、擬南芥等植物中轉(zhuǎn)錄因子WRI1同源基因的蛋白序列進行搜索，將搜索到的WRI1序列與目的基因JrWRI1的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）。結(jié)果顯示，JrWRI1與木本植物胡楊（Populus euphratica L.）的進化關(guān)系最近，與草本植物菠菜（Spinacia oleracea L.）、南瓜[Cucurbita moschata（Duch. ex Lam.） Duch. ex Poiret]等關(guān)系較遠。

2.4JrWRI1基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI在線軟件BLAST對JrWRI1基因的蛋白質(zhì)序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超級家族，在第61—133和163—227兩個位置有保守的AP2結(jié)構(gòu)域（圖5）。通過ProtParam推測其分子式為 C1961H3065N571O628S18，相對分子質(zhì)量 45 265.44，等電點6.36，JrWRI1蛋白所帶總負電荷（Asp 和 Glu）為47，總正電荷（Arg和Lys）為43。運用PredictProtein對JrWRI1的功能及亞細胞定位進行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白具有特異的DNA結(jié)合序列，可以調(diào)節(jié)生物合成和代謝過程，其定位于細胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子行使功能的特點（圖6）。

3討論

油脂合成與積累是核桃堅果品質(zhì)形成的關(guān)鍵，提高果實含油量對于增加核桃產(chǎn)量和改善品質(zhì)具有重要意義。油脂合成是一個復(fù)雜的生理生化過程，在過去的50多年，人們對種子油脂合成與積累過程有了一些了解，并成功克隆了一些油脂合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，并對其功能進行了分析，但人們對其分子調(diào)控機制的研究仍處于初級階段，且研究對象主要集中在擬南芥及其他農(nóng)作物上。近年來，有關(guān)核桃果實油脂合成代謝的研究取得一些進展，張通[11]在對山核桃果實種仁油脂合成相關(guān)基因的表達分析中發(fā)現(xiàn)了WRI1。張楠[12]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了核桃胚脂肪積累期脂肪代謝通路中關(guān)鍵基因的表達模式，為進一步研究相關(guān)基因的功能及調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)。陳虹等[13]運用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察了核桃種子油體發(fā)育過程中的超微結(jié)構(gòu)，使人們對核桃油脂的積累過程有了微觀的認識。然而核桃果實油脂合成與積累中的調(diào)控機理仍不清楚。本研究通過對核桃轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因進行克隆及生物學(xué)功能分析，初步確定其在核桃生物合成及代謝過程中起重要作用，構(gòu)建了JrWRI1基因原核重組表達載體，為進一步研究JrWRI1基因在核桃果實油脂合成與積累中的功能奠定基礎(chǔ)，期望為利用分子手段加快高油核桃新品種的選育提供有益的參考。

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