• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    奶牛卵巢中一株IBRV的分離鑒定

    2019-04-06 12:18:44程凱慧朱彤任亞初張云飛楚會萌解曉莉張亮楊宏軍
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:氣管炎傳染性奶牛

    程凱慧 朱彤 任亞初 張云飛 楚會萌 解曉莉 張亮 楊宏軍

    摘要:利用MDBK細胞從奶牛卵巢中分離到一株牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)毒株。設(shè)計擴增IBRV的通用引物,對卵巢組織中的病毒進行PCR 擴增及測序;對卵巢組織感染MDBK細胞,進行IBRV的分離培養(yǎng);測定IBRV的TCID?50,同時利用IBRV FA 進行鑒定。結(jié)果表明,分離到的病毒在MDBK細胞上產(chǎn)生了明顯的病變;用特異性引物可擴增出特異性目的條帶,目的序列與IBRV基因序列一致;該毒株的病毒滴度為106.75 TCID?50/mL。

    關(guān)鍵詞:卵巢;牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV);鑒定;細胞病變;TCID?50

    中圖分類號:S852.65+9.1文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2019)02-0117-04

    Isolation and Identification of an IBRV Strain from Cow Ovary

    Cheng Kaihui, Zhu Tong, Ren Yachu, Zhang Yunfei,

    Chu Huimeng, Xie Xiaoli, Zhang Liang, Yang Hongjun

    (Dairy Cattle Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 25013?China)

    AbstractA strain of IBRV was isolated from cow ovary with MDBK cells. The universal primer of IBRV was designed and amplified, and the ovarian tissue was used for PCR and sequencing. The ovarian tissue infected MDBK cells to isolate the IBRV; the TCID?50 of IBRV was determined and it was identified with IBRV FA. The results showed the cytopathic effect (CPE) generated in MDBK. The specific bands could be amplified by PCR with IBRV primers. The sequencing results showed that the sequence was coincided with the published IBRV sequence. The virus titration of the strain was 106.75 TCID?50/mL.

    KeywordsOvary; IBRV; Identification; Cytopathic effect (CPE); TCID?50

    牛傳染性鼻氣管炎病毒 (infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV) 又稱牛皰疹病毒Ⅰ型 (bovine herpesvirus ?BHV-1),是皰疹病毒科(Herpesviridae)α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)水痘病毒屬 (Varicellovirus)的成員。牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病,以高熱、呼吸困難、流鼻汁、上呼吸道及氣管、黏膜發(fā)炎等為特征,還可造成生殖道感染、結(jié)膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)和死胎、乳房炎等多種臨床癥狀[1]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為B類疾病,也是我國進境動物必檢疾病之一。IBRV廣泛分布于世界各地,每年給各國造成高達30億~60億美元經(jīng)濟損失,嚴重制約了養(yǎng)牛業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[2]。

    20世紀50年代首次在北美發(fā)現(xiàn)牛傳染性鼻氣管炎,70年代我國在進口的種牛中發(fā)現(xiàn)該病[3],迄今已成為全球性重要疾病。國外疫苗接種后IBRV 抗體陽性率達24.00%~66.67%[4, 5];羅玉江、馮蒙等分別報道了我國不同省市IBRV 的流行情況,陽性率為41.6%~54.1%[6-9];本研究團隊對山東省部分奶牛場進行血清學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)平均感染率為26.67%,但是奶牛卵巢中IBRV的感染率為57.00%,是病毒性卵巢炎的主要病原,給牧場造成嚴重的經(jīng)濟損失。IBRV可以在原代細胞或牛腎、肺、睪丸、鼻甲或氣管等組織細胞及已建立的細胞系如牛腎細胞(MDBK)中分離獲得。樣品多為鼻腔拭子、咽拭子、陰道拭子、包皮清洗液、流產(chǎn)胎兒的胎盤、脾、肺、腎等。鄧沛霖、孔繁德[10,11]等從牛群的陽性血清中分離到該病毒,目前沒有從卵巢中分離到該病毒的報道。本研究從無明顯臨床癥狀的奶牛卵巢中分離到一株IBRV 病毒,并經(jīng)測序等試驗進行確定。

    1材料與方法

    1.1樣品來源

    奶牛卵巢來自山東省定點奶牛屠宰場。

    1.2主要試劑與儀器

    病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司,2×Easy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,IBRV FA 熒光抗體購自青島瑞爾生物技術(shù)有限公司,MDBK細胞為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心疾病研究室保存。

    1.3引物的設(shè)計與合成

    參考GenBank中牛傳染性鼻氣管炎病毒的全基因組核酸序列,設(shè)計擴增牛傳染性鼻氣管炎病毒的通用引物,由北京六合華大基因科技股份有限公司合成,引物序列如表1。

    1.4樣品的處理

    取奶牛一對卵巢的部分組織進行研磨,反復(fù)凍融3次,用PBS稀釋相應(yīng)的樣本,5 000 r/min 離心5 min,取上清液加入青霉素 (200 IU/mL) 、鏈霉素 (100 μg/mL),用0.22 μm濾膜過濾除菌,分裝,-20℃保存。

    1.5病毒DNA的提取及PCR鑒定

    取200 μL卵巢組織上清液,按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取IBRV病毒基因組DNA。以提取的IBRV病毒基因組DNA為模板,IBRV-F/R為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系:DNA模板2 μL,Mix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,去離子水補至25 μL。PCR擴增程序:95℃ 5 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個循環(huán);72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

    1.6IBRV病毒的分離

    選擇生長旺盛的MDBK單層細胞,傾去生長液,PBS清洗兩次,接種處理好的卵巢組織上清液1 mL,37℃吸附1 h,棄去組織液,加入含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每12 h觀察細胞病變情況,連續(xù)觀察7 d。將出現(xiàn)病變(CPE)的細胞反復(fù)凍融3 次,收集細胞病毒液,用細胞病毒液再接種MDBK細胞;沒有出現(xiàn)CPE的細胞進行盲傳,盲傳到第3代,仍沒有出現(xiàn)CPE,視為陰性。

    1.7IBRV病毒TCID?50的測定

    將分離到的IBRV病毒液做連續(xù)10倍的稀釋(10-1~10-10),將稀釋好的病毒液接種到已長好MDBK單層細胞的96孔微量培養(yǎng)板中,每一稀釋度接種3孔,每孔接種100 μL,同時設(shè)置正常的細胞作為對照。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h,加入維持液100 μL,繼續(xù)在 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察CPE,連續(xù)觀察5 d,按Reed-Muench法計算TCID?50。

    1.8IBRV FA觀察熒光抗體

    將觀察完CPE的96孔培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌3遍,拍干;室溫用5%的多聚甲醛固定10 min,棄去固定液,自然晾干,再用PBS洗滌3遍,拍干;加入50 μL IBRV FITC熒光抗體,37℃孵育30 min。用PBST洗滌,拍干,在熒光顯微鏡下觀察熒光。

    2結(jié)果與分析

    2.1IBRV的PCR 鑒定

    用IBRV的特異性引物對卵巢組織上清液進行PCR 擴增,同時設(shè)立陽性、陰性對照,擴增目的片段大小為362 bp,PCR產(chǎn)物測序序列經(jīng)BLAST比對,與IBRV基因序列一致。PCR檢測結(jié)果顯示,114份奶牛卵巢組織IBRV感染率為57%(65/114),部分檢測結(jié)果如圖1。

    2.2IBRV的分離

    從114份卵巢組織中選取10份在MDBK細胞上進行分離,其中編號為53號的卵巢組織在細胞上傳至第二代出現(xiàn)明顯的CPE,細胞圓縮、拉網(wǎng),聚集成葡萄串樣,在單層細胞上形成空洞,48 h內(nèi)CPE達到80%左右,細胞大部分脫落。收集到的細胞液經(jīng)IBRV特異性引物擴增,鑒定為陽性。

    2.3IBRV的TCID?50

    顯微鏡下觀察每個稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)(表2),同時結(jié)合IBRV FA 熒光抗體的數(shù)據(jù),按Reed-Muench法計算IBRV的TCID?50,分離到的該株IBRV病毒滴度為106.75 TCID?50/mL。

    2.4IBRV FA結(jié)果

    在熒光顯微鏡下,10-1~10-5稀釋度均能觀察到熒光,10-6稀釋度只有一個孔能看見熒光,細胞呈現(xiàn)脫落、拉網(wǎng)的狀態(tài)(圖2),稀釋度越大熒光數(shù)目越少。

    3討論與結(jié)論

    牛傳染性鼻氣管炎是由IBRV引起的一種牛急性接觸性傳染病,可通過氣溶膠、病牛的直接接觸等方式傳播,但主要是飛沫經(jīng)呼吸道傳播,可形成潛伏感染和持續(xù)性感染,對牛生殖道和生殖器官有嚴重影響,包括流產(chǎn)和呼吸道疾病。病牛和帶毒動物是主要傳染源,隱性傳染的種公牛因精液帶毒,是最危險的傳染源。病愈??蓭Ф景肽甑揭荒辏踔粮L,隨著我國規(guī)?;B(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展,牛傳染性鼻氣管炎的威脅也與日俱增。

    IBRV病毒能通過血液到達生殖道,影響生殖器官,卵巢是主要的靶器官。 1985年Van der Maaten等[12]研究發(fā)現(xiàn),從未感染IBRV的奶牛配種后接種IBRV,對其卵巢產(chǎn)生多種影響。目前分離鑒定到的IBRV毒株多數(shù)是從鼻拭子、血液中分離到,還沒有從卵巢中分離到IBRV的報道。

    本研究利用MDBK細胞,首次從奶牛卵巢中分離出1株IBRV,測序后顯示與IBRV基因序列一致;該病毒在MDBK細胞上盲傳后能明顯觀察到CPE,用IBRV熒光抗體感染可以看到免疫熒光,說明該分離株為牛傳染性鼻氣管炎病毒。該研究結(jié)果為今后開展IBRV流行病學(xué)調(diào)查、篩選和選育疫苗候選毒株及診斷方法的研究提供了有價值的毒株,同時為該病的防控提供理論支撐。

    參考文獻:

    [1]薛飛, 朱遠茂, 馬磊. 我國牛傳染性鼻氣管炎研究現(xiàn)狀及防控展望[J]. 中國奶牛, 2016(6): 39-43.

    [2]王洪梅, 趙貴民, 侯佩莉, 等. 牛呼吸道疾病綜合征流行現(xiàn)狀及防控技術(shù)研究進展[J]. 中國畜牧雜志, 2015, 51(16): 33-39.

    [3]夏咸柱, 高宏偉, 華育平. 野生動物疫病學(xué)[M]. 北京:高等教育出版社, 2011.

    [4]Fulton R W, d′Offay J M, Dubovi E J, et al. Bovine herpesvirus-1: genetic diversity of field strains from cattle with respiratory disease, genital, fetal disease and systemic neonatal disease and their relationship to vaccine strains[J]. Virus Res., 2016, 223: 115-121.

    [5]Newcomer B W, Givens D. Diagnosis and control of viral diseases of reproductive importance:infectious bovine rhinotracheitis and bovine viral diarrhea[J]. Vet. Clin. N. Am. Food A., 2016, 32(2): 425-441.

    [6]王永艷, 王仲兵, 鄭明學(xué), 等. 山西省雁門關(guān)地區(qū)牛傳染性鼻氣管炎感染情況與相關(guān)因素的調(diào)查[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(6): 194-197.

    [7]Hou P, Wang H, Zhao G, et al. Rapid detection of infectious bovine rhinotracheitis virus using recombinase polymerase amplification assays[J]. BMC Vet. Res., 2017, 13(1): 386.

    [8]羅玉江. 北疆部分規(guī)?;瞿膛VD, IBR, BPI和Brucellosis的流行病學(xué)調(diào)查[D].石河子:石河子大學(xué), 2015.

    [9]馮蒙. 可視化檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒LAMP法的建立及其對流行狀況的初步調(diào)查[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

    [10]鄧沛霖, 賀榮蓮, 黃峻, 等. 傳染性牛鼻氣管炎隱性感染牛的病毒分離[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 1986(11): 4-7.

    [11]孔繁德, 徐淑菲, 周斌華, 等. 進口奶牛牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離與鑒定[J]. 中國動物檢疫, 2006(4): 29-30.

    [12]Van der Maaten M J, Miller J M. Ovarian lesions in heifers exposed to infectious bovine rhinotracheitis virus by non-genital routes on the day after breeding[J]. Vet. Microbiol., 1985, 10(2): 155-163.

    猜你喜歡
    氣管炎傳染性奶牛
    中西醫(yī)結(jié)合治療豬傳染性胃腸炎
    豬傳染性胃腸炎的治療
    乍暖還寒時奶牛注意防凍傷
    夏季奶牛如何預(yù)防熱應(yīng)激
    奶牛吃草
    豬傳染性胃腸炎的防治
    HPLC法同時測定氣管炎顆粒中7種有效成分
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:07:43
    淺談貓傳染性鼻氣管炎的診治
    《奶牛的家》
    雞傳染性喉氣管炎的診治
    美女高潮喷水抽搐中文字幕| 我的亚洲天堂| 搞女人的毛片| 好男人电影高清在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| cao死你这个sao货| 亚洲男人的天堂狠狠| 9191精品国产免费久久| 国产男靠女视频免费网站| 免费在线观看完整版高清| 欧美日韩乱码在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产熟女xx| 嫩草影视91久久| 久久香蕉国产精品| 无人区码免费观看不卡| 中文字幕av电影在线播放| 精品国产亚洲在线| 亚洲欧美激情综合另类| 久久草成人影院| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 精品久久蜜臀av无| 美女 人体艺术 gogo| 日韩大码丰满熟妇| 午夜精品在线福利| av在线天堂中文字幕| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 在线观看免费视频日本深夜| 怎么达到女性高潮| 欧美黄色淫秽网站| 97人妻天天添夜夜摸| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品 国内视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品野战在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 色综合站精品国产| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99国产精品99久久久久| 97碰自拍视频| 天天添夜夜摸| aaaaa片日本免费| 久久青草综合色| 成人特级黄色片久久久久久久| 美女免费视频网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品熟女少妇八av免费久了| 真人做人爱边吃奶动态| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜福利免费观看在线| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成人久久性| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| av福利片在线| 日本五十路高清| 日韩欧美国产在线观看| 黄色女人牲交| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| www.999成人在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 久久精品人人爽人人爽视色| 色综合站精品国产| 99在线人妻在线中文字幕| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲最大成人中文| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线观看免费视频网站a站| 91字幕亚洲| 色在线成人网| 亚洲,欧美精品.| 黄色视频不卡| videosex国产| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 大码成人一级视频| 久久久久久久精品吃奶| 午夜福利免费观看在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久伊人香网站| 97人妻天天添夜夜摸| avwww免费| 制服丝袜大香蕉在线| 无人区码免费观看不卡| 韩国av一区二区三区四区| 精品电影一区二区在线| 变态另类丝袜制服| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲av成人一区二区三| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久中文字幕一级| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产激情久久老熟女| 久久亚洲精品不卡| 日韩欧美国产一区二区入口| 黑人操中国人逼视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 免费观看人在逋| 久久中文看片网| 日本五十路高清| 午夜福利高清视频| 天天添夜夜摸| 校园春色视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产黄a三级三级三级人| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜免费鲁丝| 国产精品影院久久| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品久久电影中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲成人国产一区在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 精品一区二区三区av网在线观看| 身体一侧抽搐| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 在线观看免费午夜福利视频| 91九色精品人成在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 色综合站精品国产| 中文字幕色久视频| 一级黄色大片毛片| 国产精品九九99| 在线观看日韩欧美| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲黑人精品在线| 中文字幕久久专区| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 咕卡用的链子| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产色视频综合| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产成人欧美| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品 欧美亚洲| 在线观看免费视频日本深夜| 精品久久久久久久毛片微露脸| www国产在线视频色| 国产乱人伦免费视频| 在线免费观看的www视频| 香蕉国产在线看| 亚洲 欧美一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲七黄色美女视频| 高清在线国产一区| 国产精品影院久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 正在播放国产对白刺激| 男人舔女人的私密视频| av在线天堂中文字幕| 精品日产1卡2卡| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 在线观看www视频免费| 一a级毛片在线观看| 免费高清在线观看日韩| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲在线自拍视频| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美黄色淫秽网站| 狂野欧美激情性xxxx| e午夜精品久久久久久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 妹子高潮喷水视频| 中文字幕久久专区| 日本一区二区免费在线视频| 国产精品野战在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品九九99| 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一级毛片高清免费大全| 又紧又爽又黄一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 老鸭窝网址在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品久久久久久成人av| 免费高清在线观看日韩| 桃红色精品国产亚洲av| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲国产精品成人综合色| 操美女的视频在线观看| av天堂久久9| 亚洲最大成人中文| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 日本a在线网址| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品免费视频内射| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲成a人片在线一区二区| 色老头精品视频在线观看| 亚洲,欧美精品.| 桃色一区二区三区在线观看| 激情视频va一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 手机成人av网站| 天堂动漫精品| 国产av一区在线观看免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 老司机在亚洲福利影院| 国产精品日韩av在线免费观看 | 日韩三级视频一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 淫秽高清视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 不卡一级毛片| 叶爱在线成人免费视频播放| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 怎么达到女性高潮| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲成人国产一区在线观看| 午夜久久久在线观看| 自线自在国产av| 日本免费a在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av熟女| 欧美久久黑人一区二区| 久久狼人影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 美女免费视频网站| 操出白浆在线播放| 亚洲熟女毛片儿| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产激情欧美一区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品1区2区在线观看.| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲一区二区三区不卡视频| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 黑丝袜美女国产一区| 日韩欧美国产在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 国产高清视频在线播放一区| 男人的好看免费观看在线视频 | 中文字幕av电影在线播放| 在线永久观看黄色视频| 中出人妻视频一区二区| 国产av在哪里看| 国产成人影院久久av| 丝袜美足系列| 99热只有精品国产| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜福利一区二区在线看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产亚洲精品久久久久5区| 中文字幕av电影在线播放| 宅男免费午夜| 国产成人啪精品午夜网站| 91成人精品电影| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 丝袜美腿诱惑在线| 久久久久久久久中文| 久久精品国产清高在天天线| 精品久久久久久成人av| 国产不卡一卡二| av片东京热男人的天堂| 久久久久久人人人人人| 麻豆国产av国片精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 91成年电影在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 精品国产乱子伦一区二区三区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 亚洲国产高清在线一区二区三 | av福利片在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国内精品久久久久精免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲电影在线观看av| 电影成人av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产99久久九九免费精品| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产熟女xx| 成人免费观看视频高清| 国产激情欧美一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久久久久免费视频了| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲伊人色综图| 制服诱惑二区| 妹子高潮喷水视频| 男人操女人黄网站| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 禁无遮挡网站| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 午夜福利免费观看在线| 色综合婷婷激情| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久亚洲真实| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 看片在线看免费视频| АⅤ资源中文在线天堂| 91老司机精品| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 波多野结衣高清无吗| 国产精华一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 久久精品91无色码中文字幕| 国产精品国产高清国产av| 香蕉丝袜av| 欧美国产日韩亚洲一区| 丝袜在线中文字幕| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 最近最新免费中文字幕在线| 国产片内射在线| 国产高清视频在线播放一区| 叶爱在线成人免费视频播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 9热在线视频观看99| 国产又色又爽无遮挡免费看| 香蕉丝袜av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产不卡一卡二| 国产精品 国内视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲中文字幕日韩| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产成人精品久久二区二区91| 正在播放国产对白刺激| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 中亚洲国语对白在线视频| 午夜久久久久精精品| 国产一区二区三区视频了| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品熟女少妇八av免费久了| 日韩国内少妇激情av| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产91精品成人一区二区三区| svipshipincom国产片| 亚洲精品在线观看二区| 精品无人区乱码1区二区| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 自线自在国产av| 亚洲黑人精品在线| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久热爱精品视频在线9| 久久久精品欧美日韩精品| 国产高清videossex| 99国产极品粉嫩在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 搞女人的毛片| 美女高潮到喷水免费观看| 九色国产91popny在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线观看免费午夜福利视频| ponron亚洲| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲,欧美精品.| 精品无人区乱码1区二区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久这里只有精品19| 亚洲色图av天堂| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久这里只有精品19| 欧美久久黑人一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 长腿黑丝高跟| 在线观看免费日韩欧美大片| 热re99久久国产66热| 久久亚洲精品不卡| 一区在线观看完整版| 国产精品亚洲美女久久久| 男女下面进入的视频免费午夜 | 成人免费观看视频高清| 国产成人欧美在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜福利,免费看| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲三区欧美一区| 日韩av在线大香蕉| 麻豆成人av在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 美女国产高潮福利片在线看| 免费人成视频x8x8入口观看| 在线观看66精品国产| 久久九九热精品免费| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 真人做人爱边吃奶动态| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女国产高潮福利片在线看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产视频一区二区在线看| 丝袜人妻中文字幕| 午夜福利高清视频| 99久久精品国产亚洲精品| 国产xxxxx性猛交| 欧美中文综合在线视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美精品啪啪一区二区三区| a级毛片在线看网站| 国产精品1区2区在线观看.| 国产成人影院久久av| 亚洲成人久久性| 18禁黄网站禁片午夜丰满| av天堂在线播放| 在线av久久热| 婷婷六月久久综合丁香| 一级毛片女人18水好多| 亚洲无线在线观看| 天天一区二区日本电影三级 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 无遮挡黄片免费观看| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜免费观看网址| 中文字幕av电影在线播放| 黑丝袜美女国产一区| 国产免费男女视频| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美成人午夜精品| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久亚洲av毛片大全| 女人被狂操c到高潮| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 最新美女视频免费是黄的| 欧美日本中文国产一区发布| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av熟女| 青草久久国产| 美女国产高潮福利片在线看| a级毛片在线看网站| 老汉色∧v一级毛片| 黄色片一级片一级黄色片| 波多野结衣av一区二区av| 成人18禁在线播放| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲av第一区精品v没综合| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产av在哪里看| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲av美国av| 窝窝影院91人妻| 91成年电影在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲人成电影观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美中文综合在线视频| 亚洲久久久国产精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 90打野战视频偷拍视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久久久九九精品影院| 婷婷精品国产亚洲av在线| 色av中文字幕| 在线免费观看的www视频| 亚洲av成人一区二区三| 国产精品 国内视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品久久久久久,| 首页视频小说图片口味搜索| 动漫黄色视频在线观看| 久久国产精品影院| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 最好的美女福利视频网| 亚洲欧美激情综合另类| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美丝袜亚洲另类 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 色综合站精品国产| 看黄色毛片网站| 女性生殖器流出的白浆| 久久国产亚洲av麻豆专区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久青草综合色| 国产精品日韩av在线免费观看 | 露出奶头的视频| 在线国产一区二区在线| 露出奶头的视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 黄频高清免费视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品亚洲美女久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲av成人一区二区三| 嫩草影院精品99| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费观看精品视频网站| www.999成人在线观看| 亚洲在线自拍视频| 免费高清视频大片| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久人妻熟女aⅴ| 成人国产综合亚洲| 99riav亚洲国产免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲五月婷婷丁香| 精品国产亚洲在线| 久久久国产成人免费| 丝袜在线中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| av天堂在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 午夜福利高清视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色哟哟哟哟哟哟| 可以在线观看的亚洲视频| 色哟哟哟哟哟哟| 又大又爽又粗| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 免费看十八禁软件| 亚洲专区国产一区二区| 两性夫妻黄色片| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国内精品久久久久精免费| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产欧美网| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品1区2区在线观看.| 在线观看午夜福利视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产色视频综合| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 在线观看日韩欧美| 国产精品影院久久| 性欧美人与动物交配| 国产av一区二区精品久久| 可以在线观看毛片的网站| 色播亚洲综合网| 精品电影一区二区在线| 亚洲欧美精品综合久久99| videosex国产| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 日日爽夜夜爽网站| a级毛片在线看网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜福利欧美成人| 91大片在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产一区二区三区视频了| 精品一区二区三区四区五区乱码| 99re在线观看精品视频| 久久人妻av系列| 欧美在线一区亚洲| 久久人人97超碰香蕉20202| 最近最新中文字幕大全电影3 | 十八禁人妻一区二区| 免费看a级黄色片| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲七黄色美女视频| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品一区二区在线不卡| 叶爱在线成人免费视频播放|