野罌粟堿對哮喘和潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠肺及結(jié)腸組織相同差異表達基因的干預作用

付騫卉，柯愈詩，宋銘晶，劉偉志*

(1. 中央民族大學藥學院，民族醫(yī)藥教育部重點實驗室(中央民族大學)，北京 100081；2. 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021)

野罌粟(PapavernudicauleL.)為罌粟科罌粟屬的藥用植物, 以全草或花入藥,其味微苦微寒且酸澀,歸肺、大腸、胃、腎經(jīng)。在北方各少數(shù)民族中臨床用于鎮(zhèn)咳、止瀉時間已久。《吉林中草藥》記載野罌粟鎮(zhèn)咳、澀腸等。目前發(fā)現(xiàn)野罌粟全草的主要有效成分為生物堿，既能拮抗白三烯與其受體結(jié)合阻止炎癥反應導致支氣管痙攣和氣道高反應，又能有效降低潰瘍結(jié)腸炎模型大鼠血管活性腸肽及其受體含量,改善腹瀉癥狀促進腸黏膜組織修復，相關研究證實野罌粟堿具有鎮(zhèn)咳平喘、止瀉的作用[1-2]。

前期研究中發(fā)現(xiàn)野罌粟堿鎮(zhèn)咳止瀉的主要活性成分野罌粟堿在模型大鼠的結(jié)腸組織和肺組織中有較高濃度富集,能引起腸炎大鼠肺、大腸胞內(nèi)環(huán)核苷酸含量出現(xiàn)顯著生物學變化，實驗結(jié)果初步揭示野罌粟堿的藥效作用途徑與其歸經(jīng)作用相關[3]。歸經(jīng)，指藥物作用歸屬, 即表示藥物對機體的選擇性作用[4-5]。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序技術獲得關于特定條件下大鼠肺和結(jié)腸組織中幾乎所有轉(zhuǎn)錄物序列的全面信息,從而分析出肺、腸組織相同差異表達基因[6-7]。通過建立大鼠過敏性哮喘動物模型[8]及潰瘍性結(jié)腸炎動物模型[9]，給與野罌粟堿治療后，觀察野罌粟堿對兩組模型大鼠肺、腸組織相同差異表達基因的調(diào)控作用，試圖部分揭示野罌粟歸肺、大腸經(jīng)的分子內(nèi)涵。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠(200 ～ 220 g)，72只，雄雌各半，鼠齡8 ～ 10周，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供[SCXK (京) 2016-0002]。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房[SYXK (京) 2016-0043]，12 h/12 h晝夜循環(huán)照明及常溫環(huán)境，自由飲食飲水適應性飼養(yǎng)7 d。無菌手術在SPF級動物房內(nèi)實驗操作室[SYXK (京) 2016 - 0043]進行。本實驗涉及的動物飼養(yǎng)及動物實驗方案已得到中央民族大學生物與醫(yī)學倫理審查委員會批準[ECMUC-2018-12]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

野罌粟藥材干燥全草采集自河北承德壩上草原，經(jīng)中央民族大學藥學院朱丹教授鑒定為罌粟科罌粟屬植物野罌粟種 (PapavernudicauleL.)。

TRIzol(Invitrogen公司,USA,貨號：MRN2100);DNase I(Fermentas(MBI)公司,USA, 貨號：MRT1009);RNase抑制劑(Fermentas(MBI)公司,貨號:MRT1007);Buffer, dNTP (寶生物工程(大連)有限公司), 2 ×Ex TaqMix(寶生物工程(大連)有限公司,貨號:MPC1001);DL2000 DNA Marker(寶生物工程(大連)有限公司, 貨號：DM0101)；

Illumina 平臺PCR儀(美國ABI公司，2720型)；電泳槽(日本TaKaRa公司，Mupid 2plus)；凝膠成像系統(tǒng)(韓國Korea Biotech公司，EUV-LDUV)；離心機(韓國Hanil公司，MICRO 17TR)；漩渦混合器(美國SI公司，Voltex-Genie2)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(德國Roche公司，480II)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗藥物野罌粟有效成分(總生物堿)的制備

取野罌粟全草原植物，切段，用 8 倍量 80% 乙醇回流提取3次(2 h/次)，回收溶劑，鹽酸調(diào) pH=3 ～ 4 的酸水溶解浸膏，靜置，過濾，適量氯仿洗去脂溶性雜質(zhì)，酸水液用濃氨水調(diào)節(jié) pH=10 ～ 11，氯仿萃取 5 ～ 6 次，回收氯仿，得野罌粟堿脂溶性總生物堿，冷凍干燥，保存?zhèn)溆?。使用時取野罌粟堿總生物堿按給藥劑量配置含生藥0.18 g/mL濃度的溶液，水浴加熱至 25°C。

1.3.2 動物模型建立

(1)過敏性哮喘大鼠模型：將OVA 1 mg 和氫氧化鋁 200 mg 溶于生理鹽水 1 mL 中新鮮配制成凝膠致敏劑，第1 天和第7 天在大鼠雙側(cè)胸部，腹股溝共4 點各皮下注射0.15 mL該致敏劑，同時腹腔注射0.4 mL共計1 mL進行致敏。14 d開始將大鼠置于有機玻璃盒內(nèi)，超聲霧化吸入1% OVA 誘發(fā)哮喘，每天 1 次，每次30 min，共計1 周。以大鼠出現(xiàn)噴嚏、咳嗽、呼吸急促等典型哮喘樣發(fā)作為標準驗證是否造模成功。

(2)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型：取健康家兔結(jié)腸黏膜組織，無菌生理鹽水勻漿， 4°C離心，3000 r/min，30 min，取上清，雙縮脲法進行蛋白定量，加入等體積的完全弗氏佐劑，制成抗原乳化液。分別于第1、15、22、29天注射抗原乳化液于SD大鼠足跖、腹股溝等部位，每次含抗原8 mg。第29天麻醉后進行濃度為120 mg/mL的三硝基苯磺酸-50%乙醇 1∶1 比例灌腸復制UC 模型。通過對 UC大鼠模型的體重、大便等形態(tài)學方面的變化及便潛血實驗對模型進行評價。

1.3.3 分組及給藥

SD大鼠單只單獨飼養(yǎng)，雌雄各半，選取同批大鼠設兩組空白組(每組12只),其余SD大鼠按上述方法造模, 造模成功后隨機分哮喘模型組12只和哮喘給藥組12只與UC組12只和UC給藥組12只?？瞻捉M和兩組模型組給與等計量溶媒灌胃2 mL，給藥劑量按照大鼠和人的體表面積比確定大鼠的給藥量，即大鼠的給藥量(kg/d)=0.018×5×人的最大給藥量。野罌粟堿治療組:180 mg/kg。連續(xù)給藥7日，末日禁食禁水 24 h次日動物常規(guī)處死，解剖剪取新鮮同一位置肺組織塊與肛門上2～8 cm處結(jié)腸組織塊。

1.3.4 HE染色觀察模型形態(tài)學變化

截取部分大腸組織和肺組織固定于4%多聚甲醛，經(jīng)酒精梯度脫水(70%、80%、90%、100%I、100%II)，二甲苯石蠟包埋后將組織切成5 μm厚的薄片，并貼于載玻片上制成石蠟切片，60℃ 恒溫烘烤2 h，將石蠟切片保存。取各組的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精梯度復水(100%I、II、90%、80%、70%)，水洗，蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察各個組的組織結(jié)構(gòu)并獲取圖像。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測序分析后KEGG注釋相同差異表達基因

使用分析軟件 Cuffdiff，依據(jù)所有樣本與參考基因組比對的結(jié)果，計算每個基因在樣本中的 FPKM 值，以該值作為基因在樣本中的表達量。將兩個模型組分別與空白組進行差異顯著性分析，識別出有相同差異表達的基因基于 KEGG 數(shù)據(jù)庫，運用 BLAST 算法(blastx/blastp 2.2.24+)進行KEGG注釋。為控制計算假陽性率，采用FDR方法進行多重檢驗，找出有相同差異表達的信號通路。

1.3.6 Real-time PCR檢測C-C基序趨化因子11，碳酸酐酶1,核激素受體亞家族D組成員1的mRNA表達水平

(1)RNA提取：剪取新鮮的潰瘍組織樣品和哮喘肺組織樣品放入盛有1 mL變性緩沖液(TRIzol)的勻漿器中，冰浴 (將勻漿液移至1.5 mL EP管中，15℃～30℃ 靜置5 min(加入0.2 mL三氯甲烷充分混勻15 s，靜置 (15℃～30℃) 2～3 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上層水相置于新的離心管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min。 棄去上清,加入1 mL的80% 乙醇清洗沉淀，4℃ 12 000 r/min離心10 min,室溫風干沉淀，用 20 μL DEPC水溶解沉淀，取2 μL稀釋100倍后測定260 nm 吸光度 A，計算RNA 濃度。

(2)逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA 逆轉(zhuǎn)錄反應體系：0.1 mol/L DTT 2 μL，5×RT-buffer 4 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,RNase (40 U/μL) 0.5 μL，Oligo(dT)18(50 nmol/L)2 μL, M-MLV(200 U/μL)1 μL, RNA模板2 μg, DEPC水加至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：42℃ 60 min，70℃ 15 min，在冰上冷卻5 min備用定量PCR。

(3)引物設定：根據(jù)引物設計原則利用Primer 6.5設計Ca1、Ccl11和Nr1d1基因的引物，見表1，實驗重復3次，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參。

表1 引物序列

(4)實時定量PCR：實時定量PCR反應體系的配制：2 Ex TaqMix5 μL，Eva green 5 μL，cDNA模板1.0 μL，目的基因上游引物0.3 μL，下游引物0.3 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補至10 μL。實時定量PCR反應條件：95℃ 5min預變性后，95℃ 15 s→65℃ 30 s(熒光檢測)，45個循環(huán)。熔解曲線65℃～95℃。在 120 V 的電壓水平下,制備 2% 瓊脂糖凝膠,并提取 5 μL PCR 反應產(chǎn)物上樣于 其中進行電泳,觀察并攝取圖像。用Quantity One軟件進行圖像半定量分析,測定光密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

注:(1)結(jié)腸的形態(tài)學結(jié)果(10×10)；(2)肺組織的形態(tài)學結(jié)果(10×10)。圖1 各組大鼠腸與肺組織的組織學改變(HE染色)Note. (1) Colon tissues of each group (10 × 10). (2) Lung tissues of each group (10 × 10). Figure 1 Histological changes of the lung and intestinal tissues in each group of rats.HE staining

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型和UC模型的評價

實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)造模措施處理后，大鼠活動減少形體消瘦，毛發(fā)色澤灰暗凌亂，哮喘模型組的大鼠尤其在霧化后呼吸急促呼吸頻率明顯增高，并且大便時干時稀。潰瘍性結(jié)腸炎大鼠便血、大便不成型大便次數(shù)增多。

2.2 大鼠病理形態(tài)學觀察結(jié)果

如圖1所示，正常對照組為正常組的結(jié)腸(1)和肺組織(2)，圖(1)A結(jié)腸壁的四層分層(黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜)明顯且結(jié)構(gòu)完整，圖(2)A低倍鏡下肺組織中的肺泡結(jié)構(gòu)完整。UC模型組結(jié)腸組織(1)和肺組織(2)，通過圖(1)B可以看出結(jié)腸組織的四層分層不明顯，上皮不完整有明顯的潰瘍存在，在結(jié)腸壁的各層有大量彌散淋巴細胞；圖(2)B顯示肺泡結(jié)構(gòu)完整，但肺泡隔厚局部有炎癥團,說明結(jié)腸有炎癥同時肺組織也存在炎癥。給野罌粟堿后UC模型組結(jié)腸四層結(jié)構(gòu)明顯,肺組織中肺泡完整，但肺泡隔仍比正常組厚，但比模型組薄。經(jīng)過治療后UC組和哮喘組的肺、結(jié)腸組織的炎癥反應均有一定的緩解見圖C。圖(1)D中結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，但是黏膜層中潰瘍存在；圖(2)D中在細支氣管壁附件有大量炎癥細胞，但周圍肺泡與正常組相似，肺泡隔薄結(jié)構(gòu)完整；圖(1)E四層結(jié)構(gòu)明顯，大腸腺排列整齊，圖(2)E肺邊緣處仍有炎癥存在，肺泡隔較厚。經(jīng)給藥的大鼠食欲恢復大便逐漸成形，急促呼吸頻率減少。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序哮喘模型和潰瘍性結(jié)腸炎模型檢測差異表達基因結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組測序后，將顯著表達的基因編號進行KEGG注釋分析得到共同差異表達的基因分別為核受體亞家族1D1組，碳酸酐酶1及C-C基序趨化因子11。見表2。

2.4 野罌粟堿對兩組模型大鼠肺和腸組織中Ccl11 mRNA、Ca1 mRNA及 Nr1d1 mRNA表達的影響

RT-PCR實驗結(jié)果表示關鍵差異表達基因表達水平的變化與測序結(jié)果上下調(diào)情況基本一致，見表3、表4和圖2。Ccl11 mRNA表達在圖A中與空白組相比Ccl11 mRNA表達顯著升高(P<0.001)，與模型組比較，給藥組表達顯著降低，統(tǒng)計結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01)。圖B中UC模型組與空白組相比表達顯著升高(P<0.001)，與UC模型組比較，給藥組表達顯著降低(P<0.001)。圖C中哮喘模型組表達顯著高于空白組(P<0.01)，與模型組對比，給藥組表達降低(P<0.01)。圖D中模型組表達顯著高于空白組(P<0.001)，與模型組對比給藥組表達明顯降低(P<0.001)。Ca1 mRNA表達在圖E中，哮喘模型組表達顯著降低(P<0.001)，而給藥組表達升高(P<0.001)。圖F中UC模型組表達顯著降低(P<0.001)，給藥組表達升高(P<0.001)。圖G中，與空白組對比，哮喘模型組表達顯著低于空白組(P<0.001)，但給藥組表達升高(P<0.01)。圖H中，UC模型組表達顯著低于空白組(P<0.001)，給藥組表達明顯升高(P<0.001)。Nr1d1 mRNA表達在圖I中哮喘模型組表達顯著降低(P<0.001)，給藥組表達升高(P<0.001)。圖J中UC模型組與空白組相比表達顯著降低(P<0.001)，與模型組比，給藥組表達升高(P<0.001)。圖K中與空白組對比，模型組表達顯著低于空白組(P<0.05)，而與模型組相比給藥組表達升高(P<0.001)。圖L中與空白組對比，UC模型組表達顯著低于空白組(P<0.001)，與模型組對比，給藥組表達明顯升高(P<0.01)。

表2 兩組模型肺組織和腸組織共同差異表達基因

表3 野罌粟堿對腸組織中Ccl11mRNA、Ca1mRNA及 Nr1d1mRNA表達的影響

注：與空白對照組比較，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

Note. Compared with the blank control group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001. Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

表4 野罌粟堿對肺組織中Ccl11 mRNA、Ca1 mRNA及 Nr1d1 mRNA表達的影響

注：與空白對照組比較，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

Note. Compared with the blank control group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001. Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

注：模型與空白比較，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;給藥組與模型比較*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。A：哮喘組肺;B：UC組肺;C：哮喘組腸;D：UC組腸;E：哮喘組肺;F：UC組肺;G：哮喘組腸;H：UC組腸;I：哮喘組肺;J：UC組肺;K：哮喘組腸;L：UC組腸。圖2 野罌粟堿對Ccl11 mRNA、Ca1 mRNA及 Nr1d1 mRNA表達水平的影響結(jié)果Note. Compared with the control group, #P<0.05,##P<0.01,###P<0.001. Compared with the model group, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. A: Lung tissue in the asthma model group; B: lung tissue in the UC model group; C: intestinal tissue in the asthma model group; D: intestinal tissue in the UC model group; E: lung tissue in the asthma model group; F: UC model group lung tissue; G: asthma model group intestinal tissue; H: UC model group intestinal tissue; I: asthma model group lung tissue; J: UC model group lung tissue; K: model group intestinal tissue; L: UC model group intestinal tissue.Figure 2 Effect of Papaver nudicaule L. on the expression levels of Ccl11 mRNA, Ca1 mRNA, and Nr1d1 mRNA

3 討論

過敏性哮喘 (allergic asthma,AA)的氣道反應性增高、間歇性可逆氣道阻塞和氣道炎癥是其主要特征。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是炎癥性腸病的主要代表之一。最近研究報道發(fā)現(xiàn)炎性腸病中潰瘍性結(jié)腸炎的患者增加并發(fā)哮喘的可能性[10]。另一方面，在Raj等人[11]臨床研究中也發(fā)現(xiàn)呼吸道疾病患者炎性腸病發(fā)病率與普通人相比增加了四倍。然而此類并發(fā)癥的發(fā)病機制還未闡明，但在傳統(tǒng)醫(yī)學理論《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞·本輸》記載“肺合大腸，大腸者傳導之府”最早提出了肺與大腸相表里理論，認識到肺、腸在功能上互聯(lián)，在病理條件下相互影響[12]。長期的中醫(yī)臨床實踐也發(fā)現(xiàn) 當肺功能失常,氣機不利,則勢必影響大腸傳導功能,出現(xiàn)大便困難或腹瀉，表現(xiàn)出肺病可及腸;而若腸腑壅實,腸腑氣機失調(diào)，終致肺失宣肅,出現(xiàn)咳嗽氣喘，表現(xiàn)為腸病可及肺[13]。因而中醫(yī)在治療方針中提出肺腸合治、肺病治腸和腸病治肺等治則。通過RNA-Seq最終得到三個關鍵差異表達基因C-C基序趨化因子11，碳酸酐酶1,核激素受體亞家族D組成員1。采用RT-PCR驗證，與測序結(jié)果表達一致，說明結(jié)果重復性較好穩(wěn)定性高。經(jīng)給藥后，發(fā)現(xiàn)野罌粟堿使兩組模型肺和結(jié)腸組織中C-C基序趨化因子11表達與模型組相比顯著降低，而碳酸酐酶表達和核激素受體亞家族D組成員表達顯著升高。

C-C基序趨化因子11(Ccl11)是野罌粟歸經(jīng)作用的關鍵基因之一，也稱為嗜酸性粒細胞趨化因子，參與哮喘患者嗜酸性粒細胞氣道募集的趨化因子參與免疫反應包括先天性和適應性免疫反應[14]。有研究表明過敏性哮喘患者持續(xù)氣道嗜酸性粒細胞增多，Ccl11表達水平對于誘發(fā)哮喘病癥有實質(zhì)性的貢獻。另有研究已經(jīng)證實了Ccl11在結(jié)腸炎中的關鍵作用，UC的兩種動物模型中，DSS結(jié)腸炎模型和急性惡唑酮結(jié)腸炎模型受損小鼠的結(jié)腸組織中都發(fā)現(xiàn)Ccl11水平增加[15-16]。碳酸酐酶(carbonic anhydrase(Ca)1)也是野罌粟歸經(jīng)作用的關鍵基因之一，其屬于Cas同工酶，廣泛分布在肺泡上皮細胞，其催化反應對呼吸作用極為重要[17-18]。而在消化道，Ca主要定位于結(jié)腸上皮細胞幫助腸道吸收養(yǎng)分。白雪[19]等人研究表示，Ca在正常腸粘膜高表達，但在癌組織中明顯下調(diào),Ca不僅是人體內(nèi)調(diào)節(jié)酸堿內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關鍵酶，而且可以降低腫瘤的侵襲能力和炎癥反應的趨化能力。本次研究野罌粟歸經(jīng)作用的關鍵基因Nr1d1(nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1)，其在炎癥反應中占有重要地位[20]。最近的研究表明睡眠障礙與炎癥性疾病活動有關[21]。有報道發(fā)現(xiàn)Nr1d1具有通過改變肺部晝夜節(jié)律功能從而改善哮喘患者的呼吸功能和炎癥的能力[22]。另外Polidarova[23]等人發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律的變化也是炎性腸病尤其是結(jié)腸炎的發(fā)病機制。正常情況下，免疫系統(tǒng)具有晝夜節(jié)律性，但如果晝夜節(jié)律紊亂可能對腸黏膜屏障產(chǎn)生影響且破壞腸黏膜中的腸道微生物穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生炎癥反應[24]。

本研究在分子水平首次證明了野罌粟歸肺與大腸經(jīng)可能是通過調(diào)控這兩類疾病共同表達的相關基因。野罌粟堿治療后降低兩組大鼠模型Ccl11基因的表達，抑制了嗜酸性粒細胞向肺及腸道的浸潤募集，并且野罌粟堿能夠上調(diào)哮喘模型大鼠和UC模型大鼠肺組織和腸組織中Ca1和Nr1d1基因從而抑制促炎因子作用且降低趨化因子活性，HE染色結(jié)果也提示野罌粟堿能夠促進肺腸組織的修復功能的恢復。這項研究還有一定的不足，需進一步敲除關鍵基因觀察野罌粟堿治療哮喘模型和UC模型與空白對照組病理變化的差異性，探究其中潛在的分子基礎[25]。綜上所述，哮喘模型和UC模型大鼠肺與腸組織中的Ccl11、Ca1和Nr1d1基因可能是野罌粟“歸肺、大腸經(jīng)”選擇性調(diào)節(jié)的分子靶點。此外，基因的表達變化可能是呼吸道疾病及炎性腸病相互影響導致發(fā)病的重要機制之一，為進一步探索疾病發(fā)病機制提供基礎。