實驗動物病原PCR檢測方法系列團體標準的編制

王 靜，袁 文，閔凡貴，吳瑞可，潘金春，羅銀珠，李 舸，郭鵬舉，張 鈺，黃 韌

(廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

實驗動物是生命科學研究創(chuàng)新和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展不可或缺的支撐保障條件，被譽為“活的試劑和度量衡”，其質(zhì)量直接關系著研究和評價數(shù)據(jù)的準確性。實驗動物質(zhì)量檢測方法是實驗動物質(zhì)量管理的重要手段，標準的制定和更新是促進我國實驗動物質(zhì)量提升的主要方法。近年來，實驗動物新的疾病病原不斷出現(xiàn)，新的檢測技術不斷更新，僅靠國家標準的制定和更新已不能滿足我國實驗動物的質(zhì)量管理的需求。本項目圍繞實驗動物病原檢測技術，利用團體標準搞創(chuàng)新的優(yōu)勢，結合實際需求，制定了一批實驗動物團體標準。這些團體標準是國家標準的有力補充，對促進行業(yè)內(nèi)實驗動物質(zhì)量提升具有重要作用。

1 編制背景

我國實驗動物的管理是行政許可管理方式。國家頒布了一系列實驗動物管理法規(guī)和實驗動物質(zhì)量國家標準，各級實驗動物管理機構按照標準要求進行實驗動物質(zhì)量監(jiān)管，從而保障了我國實驗動物的標準化應用。質(zhì)量檢測是實驗動物質(zhì)量監(jiān)管的主要手段，標準的研究制定和發(fā)布實施是實驗動物質(zhì)量監(jiān)管的技術措施。因此，需要對標準不斷完善和提升，保持標準的的適用性、科學性、先進性。2018年1月1日新修訂的《中華人民共和國標準化法》開始施行，在原有的國家標準、行業(yè)標準、地方標準、企業(yè)標準外，增加了團體標準，賦予團體標準法律地位。我國標準化體系，要最終形成“強制性標準守底線、推薦性標準保基本、行業(yè)標準補遺漏、企業(yè)標準強質(zhì)量、團體標準搞創(chuàng)新”的格局。近年來，實驗動物新的疾病病原不斷出現(xiàn)，新的檢測技術不斷更新，利用團體標準搞創(chuàng)新的優(yōu)勢，開展實驗動物質(zhì)量檢測方法研究，在行業(yè)內(nèi)推廣實施團體標準，是解決目前實驗動物管理中國家標準更新滯后的較好方法[1-2]。

當前，在實驗動物檢測方法國家標準中，以針對抗體檢測的血清學檢測方法為主。但是抗體檢測有一定局限性，不能應用于非血清樣本的檢測，如對免疫缺陷動物、動物接種物、生物制品、病死動物或環(huán)境樣本的檢測。以PCR技術為基礎的病原學檢測方法，針對特定病原體核酸序列中的保守片段設計特異性引物，檢測某一種特定的病毒、細菌或寄生蟲，具有特異性強、敏感度高、診斷快速等優(yōu)點，可應用于實驗動物疾病感染的早期診斷，無血清樣本的檢測，較好地彌補了傳統(tǒng)抗體檢測方法的不足，還可應用于新發(fā)傳染病病原檢測，難培養(yǎng)的病原的檢測等，是實驗動物病原監(jiān)測的有力手段。美國和歐盟許多實驗動物質(zhì)量檢測實驗室都將PCR技術應用于實驗動物病原監(jiān)測，與抗體檢測方法并行對設施微生物污染進行控制[3]。在國內(nèi)增加實驗動物病原PCR檢測方法標準，制定成一系列團體標準，對加強實驗動物質(zhì)量和動物實驗環(huán)境設施污染的質(zhì)量控制具有重要意義。對提升和完善我國實驗動物質(zhì)量標準體系具有重要作用[3]。

2 標準范圍

本系列團體標準包括螺桿菌、小鼠細小病毒MPV株、MVM株、漢坦病毒、肺支原體、大鼠泰勒病毒、大鼠細小病毒RMV株和RPV株等17種病原PCR檢測方法(表1)。檢測項目對照國家標準已設立的病原項目有12個(表1中1～12)，其中病毒11個，細菌1個。并增設了5個目前國標中沒有要求的病原項目(表1中13～17)。

3 內(nèi)容編制

各項團體標準基本結構主要有以下內(nèi)容組成：范圍；規(guī)范性引用文件；術語、定義及縮略語；檢測方法原理；主要設備和材料；試劑；檢測方法、結果判定、檢測過程中防污染措施、附錄等。

3.1 范圍

規(guī)定了表1中所列各項病原PCR檢測方法。適用于實驗動物非血清樣本病原核酸檢測。

3.2 術語、定義及縮略語

介紹了標準中所涉及的幾種PCR檢測方法的定義，包括聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、巢式PCR、實時熒光PCR、實時熒光RT-PCR的定義。

3.3 檢測方法原理

用合適的方法提取樣本中的總RNA或/和DNA，分別針對病毒或細菌保守基因設計特異的引物探針序列，通過PCR對模板進行擴增，根據(jù)PCR檢測結果判定該樣品中是否含有某種病原特異核酸。

實時熒光PCR方法是在常規(guī)PCR的基礎上，加入了一條特異性的熒光探針，探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′→3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，淬滅作用消失，熒光信號產(chǎn)生并被檢測儀器接收，隨著PCR反應的循環(huán)進行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的增長呈對應關系。因此，可以通過檢測熒光信號對核酸模板進行檢測。

表1 已發(fā)布實施的實驗動物PCR檢測方法團體標準

3.4 設備和儀器

PCR儀、熒光PCR儀、生物安全柜等常規(guī)分子生物學實驗室儀器設備。

3.5 試劑

RNA/DNA抽提試劑、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit；One Step PrimerscriptTMRT-PCR Kit(Perfect Realtime)或其他等效產(chǎn)品。引物和探針及其他輔助試劑

引物和探針：針對實驗動物常見病原微生物核酸保守序列設計特異引物，進行PCR或反轉(zhuǎn)錄PCR擴增；根據(jù)表2和表3的序列合成引物和探針，引物和探針加無滅菌去離子水配制成10 μmol/L儲備液，-20℃保存。

3.6 檢測方法

3.6.1 樣本采集和處理

標準中方法適用于動物組織樣本、盲腸內(nèi)容物或糞便、細胞培養(yǎng)樣本、實驗動物環(huán)境樣本、飼料、墊料及飲水中病原核酸檢測。根據(jù)不同樣本處理要求，無菌采集樣本進行核酸提取，采樣過程中防止核酸降解及樣本交叉污染。

3.6.2 RT-PCR檢測

當目標病原核酸為RNA時，按RNA提取步驟進行核酸提取，再將提取的核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR反應。或者采用一步法RT-PCR試劑進行檢測。反應液的配制在冰上操作，每次反應同時設計陽性對照、陰性對照和空白對照。按標準中推薦反應體系和參數(shù)進行PCR反應，或用其他等效的PCR檢測試劑盒進行檢測，反應體系和反應參數(shù)可做相應調(diào)整。反應結束，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和拍照。

表2 普通PCR檢測引物

3.6.3 普通PCR反應

當目標病原核酸為DNA時，按DNA提取步驟進行核酸提取，提取到的DNA作模板進行PCR檢測。按標準中推薦反應體系和參數(shù)進行PCR反應，或用其他等效的PCR檢測試劑盒進行檢測，反應體系和反應參數(shù)可做相應調(diào)整。反應結束，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和拍照

3.6.4 巢式PCR或巢式RT-PCR

當待檢樣本中可能含有的目標模板DNA/RNA含量極低時，使用巢式PCR或巢式RT-PCR提高檢測敏感性。 使用巢式PCR引物進行2輪PCR，第二輪PCR反應時以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進行，反應完成后取10 μL擴增產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。

3.6.5 實時熒光PCR

采用實時熒光PCR檢測方法，可實現(xiàn)閉管操作，敏感性及特異性均優(yōu)于普通PCR，是病原檢測的首選檢測方法。根據(jù)檢測目標核酸，選擇進行RT-實時熒光PCR或者實時熒光PCR檢測。反應液的配制在冰上操作，每次反應同時設計陽性對照、陰性對照和空白對照。按標準中推薦反應體系和參數(shù)進行實時熒光PCR反應，或用其他等效的實時熒光PCR檢測試劑盒進行檢測，反應體系和反應參數(shù)可做相應調(diào)整。反應結束，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結果。

3.7 結果判定

3.7.1 普通PCR/普通RT-PCR

在陰性、陽性對照成立的條件下，即陽性對照的擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測可見到目的擴增條帶(目的片段條帶大小參見表1)，陰性對照的擴增產(chǎn)物無任何條帶，可進行結果判定。樣本孔觀察到特定大小的目的擴增條帶，判為該病原核酸陽性，否則為陰性。

3.7.2 實時熒光PCR/實時熒光RT-PCR

反應結束，對擴增曲線基線和閾值根據(jù)儀器的噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣本擴增曲線的最高點為準。質(zhì)控標準為空白對照應無Ct值，無熒光擴增曲線，陰性對照無Ct值，并且無熒光擴增曲線。陽性對照Ct值應≤35，并且有明顯的熒光擴增曲線，則表明反應體系運行正常，否則此次試驗無效，需重新進行實時熒光PCR擴增。質(zhì)控成立條件下進行結果判定。

若待檢測樣本無熒光擴增曲線，則判定該病毒核酸陰性；待檢測樣本有熒光擴增曲線，且Ct值應≤35時，則判斷該病毒核酸陽性；若待檢測樣本Ct值介于35和40之間時，應重新進行實時熒光PCR檢測。重新檢測后，若Ct值≥40時，則判定該病毒核酸陰性。重新檢測后的Ct值仍介于35和40之間，則判定該病毒核酸可疑陽性，需進一步進行序列測定。

表3 實時熒光PCR擴增引物和探針

注：未注明出處的為自行設計。

Note. Those without reference are self-designed.

3.7.3 序列測定

必要時，可取待檢樣本擴增出的陽性PCR產(chǎn)物進行核酸序列測定，序列結果與已公開發(fā)表的特異性片段序列進行比對，序列同源性在90%以上，可確診待檢樣本某種病原核酸陽性，否則判定某種病原核酸陰性。

4 編制說明

4.1 本系列團體標準的適用性說明

PCR檢測方法屬于病原學檢測方法，針對樣本中的病原核酸進行檢測，適用于非血清樣本的病原檢測，如免疫缺陷動物的健康監(jiān)測、病死動物疾病診斷、實驗動物接種物、實驗動物環(huán)境樣本檢測等，是傳統(tǒng)血清學檢測方法的補充和完善。需要指出的是，當采用血清學和病原學檢測方法對同一只動物進行檢測時，可能出現(xiàn)不一致的結果，這是由于病原感染動物后抗原和抗體不同消長規(guī)律、檢測對象不同造成。

4.2 本系列團體標準驗證情況說明

17個團體標準已通過人工感染參考毒株的組織樣品進行了方法可行性確認。完成了17項團體標準檢測方法的3家單位驗證。此外，利用9個參考毒株制備的樣本，組織了全國范圍內(nèi)的實驗室間比對，通過全國7個檢測單位建立的核酸檢測體系進行檢測方法效果評價，除了一個單位的1個病原檢測結果不一致，其它單位的檢測結果完全一致。其中，部分檢測單位使用的PCR檢測方法與團體標準規(guī)定的方法一致。

4.3 本系列標準在臨床應用的情況說明

本系列標準發(fā)布實施以來，已逐步被實驗動物業(yè)內(nèi)認識和接受，并被部分單位采納作為實驗動物病原的檢測技術手段。如螺桿菌由于培養(yǎng)條件要求較高，較難通過培養(yǎng)進行鑒定，通過PCR方法采集動物盲腸內(nèi)容物，就可以準確檢測出陽性樣本，耗時短，簡單、易行，已成為臨床螺桿菌檢測的首選方法。國外研究報導，螺桿菌的感染率高達16.08%，病毒性病原中小鼠諾如病毒(MNV)、小鼠細小病毒MPV株(MPV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠細小病毒MVM株(MVM)、小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)的感染率較高，依次為為32.37%、1.86%、1.59%、0.33%、0.26%[15]，我國實驗動物質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，MNV、TMEV、MHV、MVM、螺桿菌具有較高的感染率，依次為16.2%～42.2%[16-18]， 5.29%～15.1%[18-19]、8.5%～19.9%[18-19]、12.0%[18]和45.3%[19]。這些病原一旦污染實施，往往難以清除。本標準實施以來，本單位應用團體標準中MHV PCR檢測方法對廣東某生產(chǎn)單位轉(zhuǎn)基因動物環(huán)境樣本進行檢測，實現(xiàn)了該設施中MHV病原的逐步凈化。通過靈敏的病原PCR檢測方法，對環(huán)境設施污染的監(jiān)控是維護實驗動物設施生物安全的有利措施之一。

5 標準實施意義和展望

《實驗動物 小鼠螺桿菌PCR檢測方法》等系列團體標準的發(fā)布，為我國實驗動物新發(fā)疾病的監(jiān)控提供了標準技術方法，對提升實驗動物質(zhì)量具有重要意義，也對我們從國外引進動物的新發(fā)病原監(jiān)控提供了技術手段。制定的實驗動物高發(fā)病原新檢測方法團體標準，從病原角度控制動物質(zhì)量，再結合我國實驗動物質(zhì)量檢測國標中的抗體檢測方法，對徹底清除實驗動物高發(fā)病原提供了規(guī)范的檢測技術手段，完善了我國實驗動物質(zhì)量檢測標準。實驗動物質(zhì)量檢測技術方法團體標準的制定，將有效解決國家標準制定和更新滯后而嚴重影響實驗動物質(zhì)量問題，團體標準的創(chuàng)新模式，完善行業(yè)自律，對加速我國實驗動物質(zhì)量國家標準的制定和更新也具有重要作用。

對于實驗動物行業(yè)來說，團體標準的編制與實施，突破了標準地域限制，應大力加強行業(yè)中推廣應用，使其經(jīng)得起實踐和驗證，為轉(zhuǎn)化國家標準打好基礎。