實驗動物布魯桿菌PCR檢測方法團體標準的編制

馮育芳，邢 進，張雪青，王 洪，李曉波，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

布魯桿菌(Brucella)為革蘭陰性的多形性球桿菌，無莢膜、鞭毛、芽孢及天然質(zhì)粒，目前主要有6個種19個生物型，其中豬、牛、羊、犬種均可感染人，是重要的人畜共患病病原之一，該菌分離培養(yǎng)困難，血清學檢測方法存在特異性差、抗原難以制備等問題，急需制定新的實驗動物布魯桿菌檢測方法和標準。基于此，我們建立了實驗動物布魯桿菌PCR檢測標準，本文對標準進行了詳細解讀。

1 編制背景

布魯桿菌是一種細胞內(nèi)寄生的小球桿狀菌，可自然感染實驗犬等動物[1]，導致流產(chǎn)、不孕、睪丸炎等癥狀，降低實驗動物產(chǎn)量[2]，并威脅飼養(yǎng)人員和實驗人員的健康[3-4]，如東北農(nóng)大就發(fā)生了布魯桿菌感染事件[5]，引起政府和社會的廣泛關(guān)注[6]。為遏制布魯桿菌對實驗動物的影響，確保公共衛(wèi)生安全，加強對實驗動物布魯桿菌的綜合防治和凈化工作就顯得尤為重要。歐盟實驗動物科學聯(lián)合會和世界動物衛(wèi)生組織等已將該菌列為動物排除病原。我國實驗動物國標(GB14922.2-2001)也明確實驗犬必需排除布魯桿菌的感染。

布魯桿菌的特異性診斷方法包括病原鑒定和血清學試驗[7-9]。其中，常用方法是血清凝集試驗、試管凝集、及ELISA方法[10]。現(xiàn)行國家標準(GB/T 14926.45-2001)中規(guī)定實驗動物布魯桿菌檢測用的方法是試管凝集。而試管凝集需要使用大量的布魯桿菌抗原，該抗原的生產(chǎn)需要生物安全三級(BSL-3)及以上的特殊實驗室和布魯桿菌菌種，但大多數(shù)實驗室無法獲得布魯桿菌菌種，無法自行培養(yǎng)布魯桿菌，并獲得布氏抗原[11]。以前銷售試管凝集抗原的廠家也以不再供應該產(chǎn)品，所以實驗動物布魯桿菌檢測遇到了無法解決的瓶頸問題[7]。為此，我們需要尋求一種更加簡便的、適用于大部分實驗室的實驗動物布魯桿菌檢測方法。

為選擇合適的方法用于實驗動物的布魯桿菌檢測，我們分析了國內(nèi)外動物布魯桿菌檢測的相關(guān)標準和文獻[12-14]，發(fā)現(xiàn)多重PCR方法不需要培養(yǎng)活菌，大大減少了實驗室感染的可能性，也不需要使用布氏抗原，同時可以檢測布魯桿菌的多種型別，以減少漏檢的發(fā)生，因此，多重PCR方法成為實驗動物布魯桿菌檢測的較為合適的方法；鑒于其實用性和廣適性，該方法也適合收錄到實驗動物團體標準，推廣供各單位參考使用。

2 法規(guī)依據(jù)

依據(jù)質(zhì)檢總局、國家標準委、民政部于2017年底發(fā)布的《團體標準管理規(guī)定(試行)》的相關(guān)規(guī)定，團體標準是依法成立的社會團體為滿足市場和創(chuàng)新需要，協(xié)調(diào)相關(guān)市場主體共同制定的標準。團體標準的編寫參照GB/T 1.1《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定執(zhí)行?！秾嶒瀯游锊剪敆U菌PCR檢測方法團體標準》的制定均嚴格遵照該規(guī)定的要求執(zhí)行。

本標準收集、整理了國內(nèi)外有關(guān)組織、地方和實驗動物專業(yè)生產(chǎn)公司的實驗動物布魯桿菌檢測的先進標準，在研究分析質(zhì)量標準和控制要求的異同點后，在我國現(xiàn)有的實驗動物微生物質(zhì)量控制研究基礎之上制定。在確定本標準各項指標時，以《實驗動物管理條例》和《實驗動物質(zhì)量管理辦法》為依據(jù)，同時參考了國家標準《實驗動物 微生物學等級及監(jiān)測》、《實驗動物 微生物學檢測方法》、《實驗動物 細菌學檢測 染色法、培養(yǎng)基和試劑》和《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》，商檢行業(yè)推薦性標準《布氏桿菌檢疫技術(shù)規(guī)范》，以及國際公認的具有權(quán)威性的資料如FELASA及世界動物衛(wèi)生組織(OIE)等資料，使本標準的各項指標與國際水平接軌，符合國家標準的要求，使標準具有一定的可操作性和廣適性。

3 內(nèi)容編制

3.1 適用范圍

基于感染情況調(diào)查及實驗研究數(shù)據(jù)，實驗動物常感染牛種、豬種、犬種、羊種、綿羊種和沙林鼠種布魯桿菌。為此，本標準適用于牛種、豬種、犬種、羊種、綿羊種和沙林鼠種布魯桿菌感染的動物檢測。

3.2 檢測程序

檢測程序如圖1所示。

3.3 操作步驟

按照國家標準《實驗動物細菌學檢測標本采集》，采取EDTA抗凝血、流產(chǎn)胎盤、胎膜、精液、奶、關(guān)節(jié)液和水囊瘤液等樣本。使用商品化試劑盒提取細菌DNA，菌液可直接提取，樣本需進行研磨處理，具體提取步驟參照試劑盒使用說明。建立PCR反應體系(見表1)，PCR反應條件為：94℃ 5min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2min，重復35個循環(huán)；72℃ 7min。

如果多重PCR擴增結(jié)果相同，則用限制性內(nèi)切酶對910 bp片段進行組合酶切，酶切反應體系及條件參照限制性內(nèi)切酶說明書，KpnI只能切開沙林鼠種(690)和羊種(712)，在豬型上沒有酶切位點；EcoRI在沙林鼠種上的酶切位點是458，在另兩型上有兩個酶切位點，分別是豬種(450，652)，羊種(243，455)，見表2。利用組合酶切的方式可以區(qū)分沙林鼠種、豬種和羊種。

如條件允許，可將PCR產(chǎn)物送公司進行測序，并進行序列比對。當陽性對照出現(xiàn)相對應目的條帶，以及陰性空白對照無條帶時，檢測結(jié)果有效，對結(jié)果進行判讀。待檢樣品出現(xiàn)相應條帶時，如果難以區(qū)分是哪個種的布氏，需進行酶切鑒定；可疑樣品PCR產(chǎn)物需送公司進行測序；當測序結(jié)果和PCR結(jié)果都確定為布魯桿菌時，判定為布魯桿菌陽性結(jié)果。

圖1 檢測程序Figure 1 Detection procedure

表1 PCR反應體系

表2 不同種布魯桿菌PCR產(chǎn)物(910 bp)的酶切片段

4 未來展望

布魯桿菌的檢出要求犬廠家對陽性犬進行撲殺，基于福利倫理以及經(jīng)濟價值的考慮，我們判斷結(jié)果都需要慎重再慎重，所以對于陽性結(jié)果的判斷我們不能僅僅依賴一種方法，需要用其他的方法去驗證，布魯桿菌的分子檢測方法可以有效彌補血清學檢測方法特異性略差的問題，對結(jié)果的判斷可以更為準確，因此，該方法可以作為國標布魯桿菌檢測方法的驗證方法納入團體標準的范圍。

此外，隨著實驗動物科學的發(fā)展，實驗動物質(zhì)量標準要求的越來越高，團體標準轉(zhuǎn)化為國家標準或地方標準勢在必行，將成熟的經(jīng)實踐檢驗過的團體標準轉(zhuǎn)化為實驗動物的國家標準，也是促進我們的國家標準與國際接軌，提高我國實驗動物質(zhì)量整體水平的必然要求。

當然，隨著病原檢測技術(shù)的不斷進步，本團體標準也將在未來的實施和實踐中也會不斷的改進和提高；特別是，其他領域的標準及國際標準中的布魯桿菌診斷方法要比實驗動物國家標準中規(guī)定的布魯桿菌的檢測方法全面，我們也需要不斷的補充完善實驗動物布魯桿菌檢測方法和檢測標準，努力提升實驗動物質(zhì)量，從而保障藥品質(zhì)量評價和人民群眾的身體健康。