心肌纖維化的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展

汪 波，占貞貞，曾麒燕*

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南寧 530021；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心力衰竭研究所，上海 200120)

心肌纖維化的典型特點(diǎn)是心肌組織中細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，形成瘢痕組織，致使心肌失去正常的舒縮功能，以及影響心肌組織的電生理作用。心肌組織中的多種細(xì)胞在心肌纖維化的過程中發(fā)揮作用，包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞等[1]。成纖維細(xì)胞是心肌組織中含量最豐富的非心肌細(xì)胞，在心肌纖維化的過程中，其發(fā)揮的作用最為重要。當(dāng)心臟暴露在病理?xiàng)l件下，如壓力負(fù)荷、心肌梗死等，心肌成纖維細(xì)胞為維持心臟的正常結(jié)構(gòu)而激活增殖，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)纖維化蛋白在心肌組織中過度沉積，最終致使心力衰竭的發(fā)生[2]。

目前研究發(fā)現(xiàn)多種機(jī)制可調(diào)節(jié)心肌纖維化，包括調(diào)節(jié)起始的炎癥反應(yīng)以及纖維化相關(guān)信號通路的激活從而達(dá)到控制纖維化反應(yīng)的強(qiáng)度。在心肌壓力應(yīng)激反應(yīng)及損傷中，常伴隨著大量的心肌細(xì)胞壞死，壞死的心肌細(xì)胞釋放大量的內(nèi)源性危險(xiǎn)因子，募集炎癥細(xì)胞到達(dá)心肌組織。炎癥細(xì)胞既可以清除壞死的心肌細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，也會分泌TGF-β等促纖維化因子[3]。TGF-β主要依賴于經(jīng)典的TGF-β/smad通路，上調(diào)眾多纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌的纖維化。多種信號調(diào)節(jié)分子參與TGF-β/smad通路的調(diào)控從而控制纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，而近年來發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在心肌纖維化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中亦發(fā)揮著重要的作用。

表觀遺傳調(diào)控是指在不改變DNA堿基序列的前提下對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，其機(jī)制包括各種DNA修飾、組蛋白修飾、非編碼RNA的調(diào)控作用等。核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，由147 bp的DNA纏繞在組蛋白上形成，其中組蛋白又包括H2A、H2B、H3和H4等形成的八聚體，通過對組蛋白進(jìn)行修飾，改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，從而達(dá)到對基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控。近年來發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾、組蛋白修飾以及microRNA等表觀遺傳機(jī)制參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。

1 DNA甲基化與心肌纖維化

DNA甲基化是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要表觀遺傳修飾途徑。DNA甲基化主要集中在CpG二核苷酸的胞嘧啶5號碳原子上，散在存在于哺乳動物基因組中約70% CpG胞嘧啶存在甲基化修飾[4]，另外存在一些片段長度在200 bp以上，成簇存在于哺乳動物啟動子中或靠近啟動子區(qū)域的CpG被稱之為CpG島，與散在存在的CpG相反，CpG島通常為非甲基化狀態(tài)，但在機(jī)體處于異?；蚣膊顟B(tài)時(shí)，CpG島會發(fā)生甲基化，從而使相關(guān)基因沉默。DNA甲基化依賴于DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的協(xié)助，哺乳動物主要表達(dá)三類DNMTs，分別為DNMT3A、DNMT3B及DNMT1A，其中DNMT1A主要涉及維持DNA甲基化模式，DNMT3A/B則起到從頭催化DNA甲基化的作用[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化的發(fā)生與多種基因的DNA甲基化有關(guān)(圖1)。缺氧可通過缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α)誘導(dǎo)DNA超甲基化，并且促進(jìn)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3B表達(dá)，通過siRNA敲低DNMT3B的表達(dá)后能顯著降低膠原蛋白1和α平滑肌激動蛋白的表達(dá)；此外，利用DNMT的抑制劑也可以抑制TGF-β促纖維化的作用[6]。Tao等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在心肌成纖維細(xì)胞激活的過程中RASSF1A的表達(dá)降低，并且伴隨著DNMT3A的過表達(dá)，而DNMT3A可抑制RASSF1A的表達(dá)，并最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。另外，過度的自噬可加劇心肌肥大以及心肌纖維化，研究顯示DNMT3A可直接抑制miR-200b的表達(dá)，促進(jìn)小鼠主動脈縮窄術(shù)模型小鼠心臟自噬的發(fā)生，并最終影響著心肌纖維化的發(fā)展[8]。miR-369-5p過表達(dá)可抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖以及心肌纖維化水平，這一過程是通過miR-369-5p直接抑制DNMT3A的表達(dá)而使Patched1超甲基化抑制失活實(shí)現(xiàn)的[9]。RASAL1是一種能抑制Ras信號通路活化的Ras-GTP酶，研究顯示在纖維化心臟中RASAL1的啟動子區(qū)域超甲基化，使Ras信號通路激活增加引起心肌纖維化，而通過TET依賴的RASAL1啟動子去甲基化作用可逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的纖維化[10]。由此可見，DNA甲基化相關(guān)的修飾酶通過直接或間接的機(jī)制途徑，影響纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控心肌纖維化的程度，但是所調(diào)控的靶基因是否存在特異性，以及是否還有其他的核蛋白共同參與調(diào)控過程，需要進(jìn)一步深入研究。

2 組蛋白修飾與心肌纖維化

組蛋白是染色質(zhì)的重要組成，組蛋白尾的氨基酸末端從核小體突出，為相關(guān)修飾提供多種表觀遺傳學(xué)修飾位點(diǎn)，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。組蛋白修飾方式主要包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化以及SUMO化等[11]。與DNA修飾相似，組蛋白修飾也由不同的修飾酶介導(dǎo)，包括去乙酰/甲基化酶、乙酰/甲基轉(zhuǎn)移酶等。在心肌纖維化過程中，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；?、甲基化和磷酸化修飾及其對應(yīng)的修飾酶與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)(圖1)。

2.1 組蛋白乙酰化修飾

組蛋白乙?；臓顟B(tài)取決于嚴(yán)格控制其平衡的兩種組蛋白修飾酶：組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)。HATs催化向核小體組蛋白上的賴氨酸殘基加入乙酰基團(tuán)，導(dǎo)致染色質(zhì)松弛，使DNA與轉(zhuǎn)錄因子及其他調(diào)控因子的親和力更強(qiáng)，促進(jìn)DNA的轉(zhuǎn)錄。而HDACs催化乙?；鶊F(tuán)從賴氨酸處分離，導(dǎo)致染色質(zhì)更為緊密，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

根據(jù)在細(xì)胞中的定位，HATs可分為兩類：A型位于核內(nèi)，是核小體組蛋白乙?；闹饕呋割?，B型定位于細(xì)胞質(zhì)，主要作用是乙酰化新合成的非組蛋白如某些信號分子蛋白[13]。關(guān)于HATs在心肌纖維化中的研究仍然有限。目前已有研究表明P300與心肌纖維化有關(guān)，如CTRP3(C1q and TNF related 3)可通過抑制P300與SMAD3之間的作用從而降低心肌纖維化[14]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT8(lysine acetyltransferase 8，又稱為MOF)可以松弛NOX(NADPH oxidase)啟動子周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從而激活NOX的轉(zhuǎn)錄，在敲除MOF后可顯著降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的NOX轉(zhuǎn)錄激活、ROS的釋放、心肌梗死及后期的纖維化面積[15]，因此MOF是缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌纖維化中重要的調(diào)節(jié)分子。然而，其他的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶是否通過靶向組蛋白或非組蛋白從而參與心肌纖維化尚待探索。

對于HDACs，目前在哺乳動物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)四類18種，分別為Ⅰ型去乙?；?HDAC 1 ～ 3，8)、Ⅱ型去乙?；?HDAC 4 ～ 7，9，10)、Ⅲ型去乙?；?SIRT，SIRT 1 ～ 7)和只在人類中發(fā)現(xiàn)的第Ⅳ型去乙酰化酶HDAC11。研究發(fā)現(xiàn)，選擇性抑制Ⅰ型HDACs后可阻斷心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，解除周期蛋白依賴性激酶抑制因子P15和P57基因的抑制，最終可有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化[16]。另據(jù)報(bào)道，在充血性心衰中HDAC1和HDAC2表達(dá)升高，通過小分子抑制劑Mocetinostat抑制其活性后，可顯著降低小鼠充血性心衰模型心臟中CD90陽性心肌肌成纖維細(xì)胞的激活而逆轉(zhuǎn)心肌纖維化[17]。SAHA是一種廣譜HDAC抑制劑，SAHA處理DOCA-salt高血壓模型大鼠可有效抑制高血壓誘導(dǎo)的心肌纖維化[18]。ITF2357是一種針對多種疾病并進(jìn)入到三期臨床實(shí)驗(yàn)的HDAC抑制劑，在Dahl鹽敏感大鼠模型中，ITF2357可顯著抑制與心室舒張功能障礙有關(guān)的心肌結(jié)構(gòu)變化，包括心肌肥厚以及心肌纖維化水平[19]。SIRT2的蛋白表達(dá)在心肌肥厚心臟組織中顯著降低，研究發(fā)現(xiàn)Sirt2基因敲除小鼠中血管緊張素誘導(dǎo)的心肌纖維化顯著加重，而心臟特異性過表達(dá)SIRT2可通過直接激活A(yù)MPK下游的激酶LKB1從而抑制血管緊張素誘導(dǎo)的心肌纖維化[20]。另有研究表明HDAC6、SIRT6(sirtuin 6)和SIRT3(sirtuin 3)等都可通過不同的機(jī)制參與心肌纖維化進(jìn)程的調(diào)控[21 - 23]。因此，針對組蛋白去乙?；搁_發(fā)更為有效和特異的抑制劑對于心肌纖維化相關(guān)疾病的臨床治療研究具有重要的價(jià)值。

2.2 組蛋白甲基化修飾

組蛋白上的賴氨酸和精氨酸殘基的甲基化修飾更為復(fù)雜，賴氨酸可以發(fā)生單甲基化、雙甲基化和三甲基化修飾，精氨酸可以被單甲基化、雙甲基化[24]。根據(jù)組蛋白甲基化位點(diǎn)的不同，可導(dǎo)致不同的基因表達(dá)狀態(tài)，如H3K4me3、H3K36me3和H3K79me3等可促使基因的轉(zhuǎn)錄的激活，而H3K9me3、H3K27me3及H4K20me3等可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的抑制[25]。另外，組蛋白同一位點(diǎn)甲基化的不同修飾狀態(tài)也可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平的不同，例如H3K9me可促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，而H3K9me3則抑制基因的表達(dá)[26]。

組蛋白殘基甲基化水平的動態(tài)平衡是由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶維持的。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶至少可分為8個(gè)家族共33個(gè)成員，包括KMT1-KMT8，其中只有KMT4(lysine methyltransferase 4)缺少典型的SET催化結(jié)構(gòu)域[27]。G9a是一種能夠催化H3K9單/雙甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶，研究發(fā)現(xiàn)G9a可與MEF2C(myocyte enhancer factor 2C)形成復(fù)合體并結(jié)合異染色質(zhì)抑制抗心肌肥厚基因的表達(dá)，G9a敲除后心肌纖維化水平顯著升高，促進(jìn)心肌肥厚[28]。血管緊張素Ⅱ可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞SET1(SET domain containing 1)的表達(dá)，SET1被募集到內(nèi)皮素1啟動子區(qū)域促進(jìn)內(nèi)皮素1的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致心肌肥厚及纖維化水平增加，通過內(nèi)皮細(xì)胞特異敲除SET1可顯著降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大及心肌纖維化[29]。

組蛋白去甲基化酶已發(fā)現(xiàn)有20多種，根據(jù)同源性可分為7個(gè)亞家族，包括KDM1(lysine demethylase 1)、KDM2/7、KDM3、KDM4、KDM5和KDM6[30]。以往的研究發(fā)現(xiàn)KDM4A(lysine demethylase 4 A)缺失可顯著改善主動脈縮窄誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化程度及心肌肥大[31]。PHF8(PHD finger protein 8)可催化H3K9me1/2和H4K20me1組蛋白去甲基化，Liu等[32]的研究發(fā)現(xiàn)PHF8可通過抑制Akt-mTOR通路從而抑制主動脈縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚，并且在PHF8轉(zhuǎn)基因小鼠中TAC誘導(dǎo)的纖維化水平顯著降低。但是，對于其他種類的組蛋白甲基化或去甲基化酶，其在心肌纖維化中的功能有待進(jìn)一步研究，而且也有待開發(fā)相應(yīng)的抑制劑或激動劑，以用于心肌纖維化相關(guān)疾病的臨床治療研究。

圖1 心肌纖維化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控Figure 1 Epigenetic regulation of myocardial fibrosis

3 MicroRNA與心肌纖維化

MicroRNA是一類具有19 ～ 25個(gè)核苷酸序列的短鏈非編碼RNA。MicroRNA可與目的mRNA的3’ UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，從而降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，最終影響蛋白質(zhì)的合成[33]。MicroRNA分子在不同物種中高度保守，是多種細(xì)胞生理病理過程包括發(fā)育、增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等的重要調(diào)節(jié)因子[34]。越來越多的研究表明特定microRNA的表達(dá)與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系，在心臟疾病中，microRNA作為潛在的診斷標(biāo)志及治療靶點(diǎn)越來越受到人們的關(guān)注(圖1)。

在人及小鼠纖維化心臟中miR-125b表達(dá)顯著升高，研究發(fā)現(xiàn)miR-125b可抑制p53介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，體內(nèi)抑制miR-125b的表達(dá)可降低纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，并最終降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化水平[35]。在主動脈縮窄小鼠模型中，抑制miR-21的表達(dá)可降低激酶ERK的活性，從而抑制心肌間質(zhì)纖維化以及心功能障礙[36]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，通過納米材料靶向心梗后心臟巨噬細(xì)胞過表達(dá)miR-21，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔跃奘杉?xì)胞，最終可降低心梗后纖維化水平[37]。其他更多的研究表明miR-25和miR-29等促進(jìn)壓力負(fù)荷以及心肌梗死誘導(dǎo)的心肌纖維化，而miR-101a/b和miR-378等可通過不同的作用途徑抑制心臟纖維化的進(jìn)程[38 - 42]。這些研究表明miRNA的確參與心肌纖維化的病理過程調(diào)控，但是是否能成為心肌纖維化相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物或者治療的靶標(biāo)，還需深入探索。

4 展望

盡管心臟纖維化過程中表觀遺傳調(diào)控的研究取得了一定的進(jìn)展，但還存在著許多未知之處。近年來隨著高通量甲基化測序等新技術(shù)體系的出現(xiàn)和完善，為研究表觀遺傳調(diào)控在心肌纖維化病理生理學(xué)中的作用提供新的有效手段。目前越來越多的新的表觀修飾方式被發(fā)現(xiàn)，如在組蛋白氨基酸殘基在上還有巴豆?；?、丙?；?、丁酰化、琥珀酰化等全新的修飾類型，在RNA上存在m6A、m1A及m5C等新型修飾，以及染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)的改變等，這些新型表觀修飾方式的闡明將大大的拓展我們在心臟疾病中的研究思路。最近的研究就發(fā)現(xiàn)RNA的m6A去甲基化酶FTO(alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase)參與心肌纖維的調(diào)控[43]，那么其他的新發(fā)現(xiàn)的表觀修飾方式是否也在心肌纖維化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用將是新的研究方向。另外，這些眾多的表觀遺傳修飾機(jī)制是協(xié)同還是競爭性的參與調(diào)節(jié)不同心臟疾病誘導(dǎo)的心肌纖維化過程，又是哪些因素啟動這些表觀遺傳修飾，這些問題都有待解決。這些表觀機(jī)制的闡明將有助于我們針對各種介導(dǎo)表觀修飾的表觀酶分子，開發(fā)相應(yīng)的抑制劑或激動劑，從而用于具有巨大的潛力和前景的心肌纖維化相關(guān)疾病的臨床治療應(yīng)用研究。