淫羊藿黃酮類(lèi)成分指紋圖譜研究

牛曉靜　魯靜　段曉穎　徐立然

摘要：目的 建立淫羊藿中黃酮類(lèi)成分HPLC指紋圖譜。方法 采用Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～8 min，15%→25%A；8～25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A，32～48 min，33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，60%→85%A；70～75 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，進(jìn)樣量10 ?L。對(duì)11批淫羊藿指紋圖譜進(jìn)行相似度分析及方法學(xué)考察。結(jié)果 11批淫羊藿藥材有21個(gè)共有峰，相似度為0.845～0.952，對(duì)5個(gè)色譜峰進(jìn)行了歸屬；方法學(xué)考察結(jié)果表明，建立的分析方法重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性良好；相似度分析將11批淫羊藿分為4大類(lèi)，與淫羊藿物種鑒定結(jié)果一致。結(jié)論 不同產(chǎn)地淫羊藿有一定的相似性，HPLC指紋圖譜能夠?yàn)橐蜣降奈锓N鑒定及內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：淫羊藿；黃酮類(lèi)成分；指紋圖譜；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2019）03-0088-05

Abstract： Objective To establish HPLC fingerprints of flavonoids ingredients in Epimedii Folium. Methods The chromatographic fingerprint was obtained with Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18 （4.6 mm × 150 mm， 5 ?m） as chromatographic column， with acetonitrile （A） - water （B） as the mobile phase for gradient elution （0–8 min， 15%→25% A； 8–25 min， 25% A； 25–32 min， 25%→33% A； 32–48 min， 33%→38% A； 48–60 min， 38%→60% A； 60–70 min， 60%→85% A； 70～75 min， 15% A）. The flow rate was 1.0 mL/min， and the column temperature was maintained at 30 ℃. The detection wavelength was set at 270 nm. The similarity analysis and methodological investigation were conducted to fingerprints of 11 batches of Epimedii Folium. Results There were 21 common peaks with similarities between 0.845 and 0.952 in 11 batches of Epimedii Folium and 5 chromatographic peaks were identified. The methodological investigation results showed that the established analytical method had good repeatability， precision and stability. Similarity analysis divided 11 batches of Epimedii Folium into 4 categories， consistent with the identification results of Epimedii Folium species. Conclusion Epimedii Folium from different producing areas have a certain of similarities. HPLC fingerprints can provide basis for species identification and intrinsic quality evaluation of Epimedii Folium.

Keywords： Epimedii Folium； flavonoids ingredient； fingerprints； HPLC

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉，夏、秋季蓮葉茂盛時(shí)采收，曬干或陰干[1]。產(chǎn)地多集中在中國(guó)東北、西北、華東、西南及山西、河南等[2]，由于不同品種在形態(tài)特征、生境特征、居群大小、繁殖方式、資源利用狀況和地方土名等方面的差異，物種鑒定尚存在諸多疑問(wèn)[3-4]。指紋圖譜是基于對(duì)中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識(shí)，借助波譜和色譜等技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，是實(shí)現(xiàn)鑒別中藥真實(shí)性、評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點(diǎn)，能對(duì)中藥內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行有效表征、綜合評(píng)價(jià)和全面控制[5]。本課題組采用指紋圖譜方法對(duì)淫羊藿黃酮類(lèi)成分進(jìn)行分析，并對(duì)5種黃酮類(lèi)成分進(jìn)行歸屬，為淫羊藿的物種歸屬和鑒定提供一定依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），Waters 2998型紫外檢測(cè)器（美國(guó)沃特世公司），TU-1800PC型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），CP225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)），BSA224S-CW型電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）。

11批淫羊藿編號(hào)為S1～S11，依次為箭葉淫羊藿（20140217-1，東北吉林）、淫羊藿（130716，甘肅隴南）、柔毛淫羊藿（20140303，四川）、箭葉淫羊藿（20140303-2，甘肅）、淫羊藿（130107，甘肅陽(yáng)縣）、箭葉淫羊藿（20140303-1，甘肅）、朝鮮淫羊藿（20140217-2，東北吉林）、淫羊藿（20140303，陜西）、箭葉淫羊藿（140301，甘肅隴南）、朝鮮淫羊藿（131107，遼寧遼陽(yáng)）、朝鮮淫羊藿（131015，吉林通化），經(jīng)本院陳天朝主任藥師鑒定，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）規(guī)定。淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)分別為110737-200415、111852- 201102），中國(guó)食品藥品檢定研究院；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C（批號(hào)分別為130520、130518、130601），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～8 min，15%→25%A；8～25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A；32～48 min，33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，60%→85%A；70～75 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 ?L。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)均不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解稀釋?zhuān)瞥苫旌蠈?duì)照品溶液，濃度分別為朝藿定A 48.84 ?g/mL、朝藿定B 95.2 ?g/mL、朝藿定C 0.1031 mg/mL、淫羊藿苷52.5 ?g/mL、寶藿苷Ⅰ6.475 ?g/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，再稱(chēng)定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。進(jìn)樣前用0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取淫羊藿樣品（批號(hào)130716），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖。以參照峰的保留時(shí)間和峰面積為參比，結(jié)果供試品溶液中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.971%，相對(duì)峰面積的RSD為0.15%～2.97%，表明該方法精密度好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取淫羊藿樣品（批號(hào)130716），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果供試品溶液中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.13%～1.48%，相對(duì)峰面積的RSD為0.56%～3.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取淫羊藿樣品（批號(hào)130716），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果24 h內(nèi)供試品溶液中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.19%～3.38%，相對(duì)峰面積的RSD為0.526%～2.65%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取空白溶液10 ?L，注入色譜儀，按規(guī)定的梯度條件洗脫，結(jié)果表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.4 樣品測(cè)定

取11批淫羊藿樣品（見(jiàn)表1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 特征指紋圖譜的建立

2.5.1 參照峰的選擇

在各批樣品指紋圖譜中，淫羊藿苷的保留時(shí)間居中，分離度良好，且為淫羊藿的主要黃酮類(lèi)成分之一，故確定13號(hào)峰淫羊藿苷為參照峰（S）。

2.5.2 特征指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

將11批淫羊藿色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）》進(jìn)行自動(dòng)匹配，以淫羊藿共有模式圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，11批淫羊藿的相似度為0.845～0.952，同時(shí)確定了21個(gè)共有峰，根據(jù)對(duì)照品保留時(shí)間與紫外光譜圖指認(rèn)了其中10、11、12、13、20號(hào)峰分別為朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ，共有模式見(jiàn)圖2，混合對(duì)照品HPLC圖見(jiàn)圖3。11批淫羊藿指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表1、表2，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)各批淫羊藿指紋圖譜進(jìn)行直觀分析可見(jiàn)，保留時(shí)間52 min之前的色譜峰有良好的相似度；保留時(shí)間在52～75 min之間的極性相對(duì)較小的成分各批次之間有較大差異，其中，S1～S9號(hào)各色譜圖比較相似，與S10、S11號(hào)色譜圖有較大差異。根據(jù)相似度評(píng)價(jià)可以看出，不同產(chǎn)地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差異，各共有峰峰面積差異較大，黃酮類(lèi)成分含量有較大差異。S2、S5、S8相似度在0.990～0.995，S7、S10、S11相似度在0.990～0.995，S1、S4、S6、S9相似度在0.952～0.971。這3類(lèi)相似度較高的樣品分別為淫羊霍、朝鮮淫羊藿、箭葉淫羊藿，與淫羊藿物種鑒定結(jié)果一致，而S3與其他批次有差異，為柔毛淫羊藿。

3 討論

指紋圖譜在中藥質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和控制方面有很大的發(fā)展，在化學(xué)指紋圖譜、生物指紋圖譜和代謝指紋圖譜等技術(shù)方面都有突破性的進(jìn)展。除用于考察中藥材的歸屬、鑒別[6-10]，以提供生產(chǎn)前原料藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣的鑒別依據(jù)，更可用于中藥生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制，追蹤制劑中某些化學(xué)成分的變化，監(jiān)測(cè)原料藥材與成品之間、成品各批次間質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性[11-14]。

淫羊藿因物種來(lái)源不同，質(zhì)量有差異，某些產(chǎn)地樣品相似度不好，這給進(jìn)一步對(duì)淫羊藿進(jìn)行藥效學(xué)研究帶來(lái)極大不便。本研究建立了淫羊藿中黃酮類(lèi)成分的指紋圖譜方法，并對(duì)其中5個(gè)成分進(jìn)行指認(rèn)，方法簡(jiǎn)便快捷、精密度、重復(fù)性良好，結(jié)果表明能夠客觀反映各共有峰所代表的化學(xué)成分含量高低，11批樣品相似度為0.845～0.952。不同產(chǎn)地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差異，指紋圖譜能夠?yàn)橐蜣降奈锓N鑒定及內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，更能反映出淫羊藿各有效成分含量的綜合差異。

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（收稿日期：2018-02-27）

（修回日期：2018-05-23；編輯：陳靜）