小麥發(fā)芽過程中酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的變化

金舟，徐穎，王敏，王津，王莎莎，劉零怡,2*，沈汪洋,2，劉連亮

1(武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢，430000) 2(大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢，430000) 3(寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波，315800)

小麥(TriticumaestivumL.)是三大谷物之一，2010年小麥成為世界上總產(chǎn)量位居第二的糧食作物(6.51億t)，僅次于玉米(8.44億t)[1]。小麥富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、鈣、鐵、硫胺素、核黃素、煙酸及維生素A等[2]。小麥成熟和收獲的季節(jié)通常伴隨著潮濕多雨的天氣，導(dǎo)致大量小麥發(fā)芽，從而影響小麥的品質(zhì)[1，3-4]。然而，文獻資料表明，發(fā)芽小麥具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、增強免疫力、延緩衰老、降膽固醇、降血脂、降血糖等功能[5]。發(fā)芽過程中小麥會形成多種生理活性物質(zhì)，如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)[6]，它是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳達物質(zhì)[7]。

目前對發(fā)芽小麥中活性成分的研究主要集中于發(fā)芽小麥γ-氨基丁酸的富集、提取和應(yīng)用[8-9]，而對其中的酚類化合物關(guān)注較少。本研究以扶麥1228為實驗材料，研究小麥發(fā)芽過程中酚類化合物(酚酸和黃酮)種類及含量的變化，比較發(fā)芽時間對其影響，并探討這一過程的抗氧化活性變化，為發(fā)芽小麥深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：小麥(扶麥1228，產(chǎn)自湖北省，市售)，甲醇(HPLC級純度，產(chǎn)自TEDIA)，乙腈(HPLC級純度，產(chǎn)自TEDIA)，2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ，分析純)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，分析純)，2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，分析純)，蒸餾水，其他分析純試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

人工氣候培養(yǎng)箱，億恒科技有限公司；烘箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；紫外分光光度計(UV-1800PC),MAPADA；低速離心機(SC-3612)，中佳；純水機，優(yōu)普特；超聲波清洗機(SB-5200DTN)，寧波新芝生物科技股份有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-Z)，國華電器有限公司；萬分之一電子天平(LE204E)，Mettler Toledo；UPLC,美國Waters。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同發(fā)芽時間發(fā)芽小麥的制備

隨機選取20粒小麥種子，測得平均粒長為(0.71±0.03)cm。按照《GB/T 5520—2011 糧油檢驗籽粒發(fā)芽試驗的方法》制備不同發(fā)芽時間的發(fā)芽小麥，按照0、2、5、8和11 d的發(fā)芽時間使小麥發(fā)芽。將發(fā)芽好的小麥放到50 ℃的熱風(fēng)干燥箱里面烘10 h，然后將烘干的發(fā)芽小麥放進萬能粉碎機里面粉碎2 min，得固體粉末待用。

1.3.2 樣品提取方法

稱取粉碎好的不同發(fā)芽時間樣品粉末各0.5 g于25 mL錐形瓶中，按照1∶20(g∶mL)料液比添加體積分數(shù)為60 %甲醇溶液。將樣品放在超聲波清洗機中以60℃溫度下超聲90 min[10]。超聲完畢后，將提取液放入15 mL離心管中以2 194×g離心25 min，取上清液，放入4℃冰箱貯藏[11]。

1.3.3 總酚含量的測定

準(zhǔn)確稱取沒食子酸對照品10 mg，用超純水溶解并定容到10 mL，質(zhì)量濃度為1 mg/mL。吸取沒食子酸對照液0、0.04、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56 mL于10 mL容量瓶并用體積分數(shù)為60%的甲醇溶液定容。各加入1.0 mL福林試劑和2.0 mL質(zhì)量濃度200 g/L Na2CO3水溶液，(50±1)℃恒溫水浴中加熱30 min后，用水冷卻并稀釋至25 mL。室溫放置30 min，在1 cm比色杯測定745 nm處吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL的待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的步驟，于745 nm處進行吸光度的測定。

1.3.4 總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，相當(dāng)于蘆丁0、75、150、300、450、600 μg移入10 mL刻度比色管中，加入體積分數(shù)為30%的乙醇溶液至5 mL，各加5 g/L NaNO2溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，加入10 g/L Al(NO3)3溶液0.3 mL搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L NaOH溶液2 mL，用體積分數(shù)為30%的乙醇定容至刻度，以零管為空白，搖勻后用1 cm的比色杯在510 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或求取線性回歸方程[12]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出試樣的黃酮含量。

1.3.5 超高效液相檢測酚類化合物種類及含量

UPLC分析條件為：Thermo色譜柱Hypersil Gold(150 mm×2.1 mm，1.9 μm)；進樣量1 μL；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃，PDA檢測波長為280 nm；流動相A為甲醇和乙腈等比例混合的溶液，流動相B為體積分數(shù)2.5%的乙酸溶液，超高效液相色譜梯度洗脫條件為：0～6 min，20%A；6～15 min，40%A；15～18 min，70%A；18～24 min，5%A[13]。以沒食子酸、咖啡酸、羥基酪醇、香草醛、對羥基苯甲酸、綠原酸、芹菜素、沒食子酸、阿魏酸、蘆丁、對香豆酸、木犀草素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時間定性、峰面積定量檢測不同發(fā)芽時間發(fā)芽小麥中上述酚類化合物的含量。

1.3.6 發(fā)芽小麥抗氧化能力的測定

1.3.6.1 ABTS法測定發(fā)芽小麥抗氧化能力

ABTS液的配制：將176 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液和10 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液混合，避光靜置12～16 h，形成ABTS+·儲備液。用無水乙醇將ABTS+·溶液稀釋至吸光值為0.700±0.02(734 nm波長下)，貯存于棕色瓶內(nèi)備用[14]。取待測樣溶液0.1 mL和 3.9 mL ABTS+·溶液混合搖勻，室溫下反應(yīng)6 min,在734 nm波長下測定吸光值A(chǔ)s；同時測定0.1 mL樣品提取、稀釋溶劑(蒸餾水)和3.9 mL ABTS+·溶液的吸光度A0，以及0.1 mL待測樣溶液和3.9 mL ABTS+·溶液的溶劑(無水乙醇)吸光度Ar，陽性對照為維生素C(VC)。

1.3.6.2 發(fā)芽小麥中DPPH清除率

準(zhǔn)確稱取DPPH試劑20 mg，用無水乙醇定容至500 mL容量瓶中，搖勻貯存于棕色瓶中備用。取待測樣溶液0.2 mL(所用測試樣品均溶解在蒸餾水中)和3.8 mL DPPH溶液混合搖勻，室溫下反應(yīng)1 h，在517 nm波長下測定吸光度As；同時測定DPPH溶液與等體積(0.2 mL)蒸餾水的吸光度A0，以及0.2 mL待測樣溶液與3.8 mL DPPH溶液的溶劑(無水乙醇)吸光度Ar，陽性對照為Trolox[14-15]。

1.3.6.3 發(fā)芽小麥FRAP值的測定

以10∶1∶1體積比混合300 mmol/L醋酸緩沖液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液。吸取100 μL系列濃度為200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μmol/L的FeSO4溶液，與3.9 mL FRAP溶液混合，在37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，于593 nm下讀取吸光值，以FeSO4溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14,16]。吸取100 μL待測樣品，與3.9 mL FRAP溶液混合，在37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，于593 nm下讀取吸光值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得待測樣品相應(yīng)的硫酸亞鐵濃度，定義為當(dāng)量濃度(FRAP值)。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

本文數(shù)據(jù)處理采用SPSS 24進行顯著性分析，Origin 2017和Excel 2010等圖表制作軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)芽時間小麥總酚和總黃酮含量的變化

根據(jù)發(fā)芽小麥發(fā)芽時間和芽長，分為15組樣品，具體如表1所示。

表1 樣品信息Table 1 Samples information

圖1為不同發(fā)芽時間小麥中總酚和總黃酮含量的變化。未發(fā)芽小麥(空白)總酚含量為(1.36±0.12)%。隨著發(fā)芽時間延長，總酚含量持續(xù)增加?？偡雍吭诘?天達到峰值，之后略有下降，但并無

圖1 不同發(fā)芽時間小麥總酚和總黃酮含量變化Fig.1 Changes of total phenols and total flavonoids in wheat with different germination time

顯著差異(P>0.05);總黃酮含量在第11天達到峰值。同時，隨著發(fā)芽時間的增加，麥粒變得干癟，第11天干癟程度最大。

2.2 發(fā)芽小麥多酚種類和含量的測定

采用UPLC法檢測不同發(fā)芽時間下小麥中的酚類化合物(表2)，可以看出，隨著發(fā)芽時間的增加，小麥中酚類化合物的含量總體上呈上升的趨勢，酚類物質(zhì)的種類也增加，均高于未發(fā)芽小麥。在8～11 d達到最高。

表2 不同發(fā)芽時間下小麥中酚類化合物的含量 單位：μg/g

2.3 發(fā)芽小麥的抗氧化活性

從圖2可以看出，隨著發(fā)芽時間的延長，發(fā)芽小麥中活性物質(zhì)的抗氧化活性不斷增強，發(fā)芽和未發(fā)芽小麥之間DPPH和ABTS抑制率以及鐵離子還原力(FRAP)的差異非常顯著(P< 0.01)。隨著發(fā)芽時間的延長，小麥中的活性物質(zhì)對ABTS、 DPPH的抑制能力和鐵離子還原力均逐漸增強，對比小麥發(fā)芽過程中酚類化合物含量和成分的變化，這可能是發(fā)芽小麥中阿魏酸，咖啡酸，蘆丁等活性物質(zhì)的含量有顯著提高(P<0.05)，導(dǎo)致發(fā)芽小麥抗氧化活性增強[17]。

A-DPPH%清除率；B-ABTS%清除率；C-FRAP值圖2 發(fā)芽小麥樣品的抗氧化活性測定Fig.2 Antioxidant capacities of germinated wheat samples

3 結(jié)論

本文研究了發(fā)芽小麥中酚類化合物的種類與含量，進一步研究發(fā)芽小麥抗氧化活性強弱。根據(jù)總酚含量、總黃酮含量、抗氧化活性數(shù)據(jù)可知，長時間的發(fā)芽能夠增加發(fā)芽小麥內(nèi)酚和抗氧化能力。與未發(fā)芽小麥相比，發(fā)芽小麥總酚含量更高，酚類化合物種類更加多樣，抗氧化活性更強。因此發(fā)芽小麥可以作為一種潛在的天然抗氧化劑來源，為綠色健康食品的加工提供參考。