天然及還原型紅曲黃色素的差異與國家標準改進思考

譚海玲，黃濤，陳功，石侃，張薄博，許贛榮，吳振強*

1 (華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州, 510006)2 (武漢工程大學 環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北 武漢, 430205) 3 (西北農(nóng)林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌, 712100) 4 (糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫, 214122) 5(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

紅曲色素是紅曲菌次級代謝物，通常是紅、橙、黃三類色素的混合物，作為天然食用色素已具有悠久歷史，廣泛應用在肉制品加工、醬油、果汁飲料、化妝品中[1]。早期主要是以紅曲紅色素的形式被大眾接受，隨著紅曲黃色素的研究深入，紅曲黃色素產(chǎn)品凸顯出了巨大的市場潛力。紅曲色素的應用源于東南亞國家，隨著全球經(jīng)濟一體化的發(fā)展，國際市場對紅曲色素的需求量日益增加[2-3]。制約我國紅曲色素進入國際市場的瓶頸主要是產(chǎn)品中桔霉素含量無法達到國際認可的標準，日本食品添加劑協(xié)會將紅曲色素中桔霉素的限量指標定為0.2 mg/kg，歐盟對紅曲霉發(fā)酵大米食品補充劑中最大限量值為2 mg/kg[4]。因此，制定先進科學的國家標準，提升紅曲色素品質(zhì)，是提高我國紅曲色素產(chǎn)業(yè)國際競爭力的關鍵。

然而，目前只有紅曲紅色素的國家標準以及還原型紅曲黃色素的國家標準，還未有天然紅曲黃色素的國家標準出臺，嚴重制約著紅曲黃色素的開發(fā)利用。因此，亟需行業(yè)內(nèi)人士參與探討并制定更加完善的紅曲黃色素國家標準。本文將分別綜述天然紅曲黃色素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，并與國家標準GB 1886.66—2015提及的還原型紅曲黃色素作比較，希望行業(yè)內(nèi)外對紅曲黃色素有更加深入的認識，為充實和完善紅曲黃色素的國家標準等提供參考。

1 天然紅曲黃色素與還原型紅曲黃色素的分子結(jié)構(gòu)比較

1.1 天然紅曲黃色素

近年來，紅曲黃色素受到國內(nèi)外眾多研究者的關注，不斷有新型色素被發(fā)現(xiàn)。CHEN等[5]總結(jié)了從1932—2011年被報道的35種紅曲黃色素，其中31種屬于天然紅曲黃色素；水溶性紅曲黃色素有6種，其中只有2種是天然紅曲黃色素。LIU等[6]在2016年使用紅曲菌突變菌株ΔMpigJ-R發(fā)酵大米，得到新的紅曲黃色素M7PKS-1。HUANG等[7]在2017年使用紅曲菌MonascusruberCGMCC10910經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵得到4種水溶性天然紅曲黃色素Y1，Y2，Y3，Y4，經(jīng)初步鑒定，Y1為已報道黃色素Azanigerone E，其他色素結(jié)構(gòu)尚未報道。同年，CHENG等[8]使用產(chǎn)黃色素紅曲菌突變菌株進行大米固態(tài)發(fā)酵，得到1種新的紅曲黃色素Monascusmellein，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定，該色素為雙氫異香豆素衍生物。表1給出了已報道的天然紅曲黃色素的特性參數(shù)，包括分子式、分子量和最大紫外吸收值等，部分新型色素結(jié)構(gòu)特性有待進一步研究補充。

紅曲色素是一系列聚酮化合物的混合物，其聚酮合成途徑可分為2個分支：1個分支是經(jīng)過聚酮體合酶的催化，3分子丙二酰CoA和1分子乙酰CoA生成四酮化合物，接著以四酮化合物為底物，形成聚酮發(fā)色團[22]；另1個分支是乙酸和丙二酸在脂肪酸合成酶的作用下生成β-酮酸[23]。該2種途徑合成的產(chǎn)物在色素合酶的作用下形成胞內(nèi)色素，胞內(nèi)色素經(jīng)糖基化或?；磻赊D(zhuǎn)化為胞外水溶性色素。使用不同的菌種、發(fā)酵底物、培養(yǎng)條件會對紅曲色素的結(jié)構(gòu)帶來差異，從而造成天然紅曲黃色素結(jié)構(gòu)的多樣性，代表性的天然紅曲黃色素結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 部分天然紅曲黃色素結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of some natural Monascusyellow pigments

在日本，Yaegaki BioIndustry公司已經(jīng)采用發(fā)酵模式大規(guī)模生產(chǎn)天然紅曲黃色素，實現(xiàn)商品化生產(chǎn)，商品名為High-moon Yellow S 200A的產(chǎn)品主要以如圖2兩種物質(zhì)組成[24]，分別是Xanthomonasin A及其異構(gòu)體。

圖2 組成High-moon Yellow S 200A產(chǎn)品的紅曲黃色素分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of natural Monascus yellow pigments in High-moon Yellow S 200A

1.2 還原型紅曲黃色素

中國于2015年11月13日發(fā)布了“食品添加劑

紅曲黃色素”國家標準(GB 1886.66—2015)[25]，該標準中紅曲黃色素是以紅曲米為原料，經(jīng)堿液洗脫分離制得紅曲紅(或直接以紅曲紅為原料)，然后通過堿解反應生成羧酸鹽，以特定的含氧硫化物作為還原劑，使紅色素中的環(huán)羰基還原成羥基，從而生成水溶性紅曲黃色素。在結(jié)構(gòu)上，GB 1886.66還原型紅曲黃色素是在微生物代謝后運用化學法改性而得到的紅曲色素衍生物，與直接發(fā)酵生產(chǎn)的天然紅曲黃色素有相似的骨架。經(jīng)過結(jié)構(gòu)分析，認為紅曲紅色素與連二亞硫酸鈉在堿性溶液中進行反應，紅曲紅色素分子中的內(nèi)酯被水解，生成羧酸鹽和醇，同時引入磺酸基，制得水溶性紅曲黃色素[26]。YANG等[27]以市場上流通的水溶性紅曲黃色素為研究對象，進行分離純化，鑒定出8種主體組分的結(jié)構(gòu)，其中化合物3、化合物7和化合物8為水溶性紅曲黃色素的主要組分，而化合物7與化合物8均含有磺酸基，如表2所示。

表2 含有磺酸基的還原型紅曲黃色素[26]Table 2 Reduced Monascus yellow pigments with sulfonic acid group

2 天然紅曲黃色素與轉(zhuǎn)化紅曲黃色素的性能比較

2.1 溶解性與穩(wěn)定性

2.1.1 天然紅曲黃色素

天然紅曲色素可分成親水性和疏水性兩大類，大部分天然紅曲色素是疏水性色素，在乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑中溶解性較好；而天然水溶性紅曲色素較少，可以從紅曲菌液態(tài)發(fā)酵的液體中直接分離得到[28]。張慶慶等[29]比較天然水溶性和醇溶性紅曲色素的光穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在相同光照條件下，水溶性色素光穩(wěn)定性大于醇溶性色素；同時得出波長較長的單色光對天然紅曲色素的保存率影響較低，而紫外線對天然紅曲色素的穩(wěn)定性影響較大。楊玲等[30]對液態(tài)發(fā)酵的天然紅曲黃色素的穩(wěn)定性進行了深入的研究，結(jié)果顯示紅曲黃色素在酸性條件下較穩(wěn)定，顏色趨于亮黃色；而在中、堿性條件下顏色變成紅色。在熱穩(wěn)定性方面，紅曲黃色素溶液在100 ℃下加熱60 min，吸光度殘存率為95%，經(jīng)80 ℃烘箱加熱2 d，吸光度殘存率在70%以上；說明天然紅曲黃色素具有較好的耐熱性。另外，添加0.03%的茶多酚可以明顯提高紅曲黃色素的光穩(wěn)定性。楊強等[31]研究發(fā)現(xiàn)Na+、K+、Ca2+和Zn2+對液態(tài)發(fā)酵的天然紅曲黃色素基本無影響，但Fe2+和Cu2+會使黃色素發(fā)生變色并產(chǎn)生沉淀。

與還原型紅曲黃色素不同，天然紅曲黃色素在我國尚未實現(xiàn)工業(yè)化，對其穩(wěn)定性研究有待加強。

2.1.2 還原型紅曲黃色素

蘇金為等[32]對還原法生產(chǎn)的水溶性紅曲黃色素的性質(zhì)進行研究，顯示其最大吸收波長是476 nm，即國家標準GB 1886.66描述的紅曲黃色素的最大吸收波長，與天然紅曲黃色素的最大吸收波長(一般為410 nm左右)不一致。還原法生產(chǎn)的紅曲黃色素可以溶于多種偏極性的溶劑，很難溶解于非極性的溶劑，水溶液下顯橙黃色，固體狀態(tài)下100 ℃加熱2 h，吸光度下降小于5%，對各種金屬離子穩(wěn)定。容艷筠等[33]研究了還原法生產(chǎn)的紅曲黃色素的耐酸堿、耐高溫高壓和光熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其在pH值為3～10的范圍內(nèi)穩(wěn)定性基本不變化，100 ℃下水浴加熱，0.1 MPa、121 ℃下滅菌，太陽光照射，紫外光照射等條件下，色素殘留率均較高，說明該色素光熱穩(wěn)定性好。

2.2 生物活性

2.2.1 天然紅曲黃色素

研究表明天然紅曲黃色素不僅具有降血糖、降血壓、降血脂的功能，還具有抗炎癥、抗癌癥、抗腫瘤等功能[34-39]。大部分研究主要集中在2種經(jīng)典的醇溶性天然紅曲黃色素紅曲素和安卡紅曲黃素。LEE等[40]研究發(fā)現(xiàn)紅曲素可以增強PPAR-γ結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，阻止其磷酸化，同時抑制c-Jun氨基末端激酶的激活，從而改善胰島素抵抗癥狀。LIN等[41]報道，紅曲素和安卡黃素可以降低由腫瘤壞死因子TNF-α誘導的內(nèi)皮黏附性，減少與炎癥相關的血管疾病的發(fā)生。AKIHISA等[42]使用小鼠模型，發(fā)現(xiàn)紅曲素可以減少由過氧化硝酸或者紫外誘導的皮膚癌。SU等[43]發(fā)現(xiàn)安卡紅曲黃素對人體肝癌細胞株Hep G2和肺癌細胞A459有明顯的抑制作用，半抑制濃度均為15 μg/mL，相同濃度安卡紅曲黃素對人體正常細胞MRC-5和WI-38并沒有細胞毒性。CHENG等[44]研究發(fā)現(xiàn)紅曲素和安卡紅曲黃素通過抑制Akt / NF-κB/ p38信號通路誘導活化的肝星狀細胞凋亡，從而達到預防肝硬化的作用。SHAYMAA等[45-46]把紅曲素和安卡黃素裝載于納米膠束中，增強其對乳腺癌細胞的抑制作用。CHENG等[47]使用酒精誘導小鼠肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)紅曲素和安卡紅曲黃素通過調(diào)節(jié)抗氧化酶和酒精代謝酶的活性從而保護肝細胞。這些研究成果表明，一定劑量的天然紅曲黃色素可以在醫(yī)藥領域中應用。

2.2.2 還原型紅曲黃色素

目前還沒有學者對還原型紅曲黃色素(GB 1886.66國標方法生產(chǎn))的生物活性進行報道。陳冠敏等[48]對市售紅曲黃色素進行亞慢性毒性試驗，得出在一定使用范圍內(nèi)，紅曲黃色素對人體健康不存在潛在的毒性作用,可以作為著色劑應用在食品加工業(yè)。GB 1886.66紅曲黃色素在生產(chǎn)過程中使用硫化物，可能會造成原料的殘留，因此在生產(chǎn)過程中需要嚴格的質(zhì)量控制體系。

3 紅曲黃色素國家標準改進的思考

隨著紅曲色素研究的深入，對色素的組成及分子特性有了更科學的理解，因此相應的國家標準也不斷完善，如2016年發(fā)布的“紅曲紅”國家標準(GB 1886.181—2016)[49]是第3次修訂，前2次分別于2005年(GB 15961— 2005)和1995年(GB 15961—1995)發(fā)布。紅曲黃色素的開發(fā)稍晚，其國家標準(GB1886.66—2015)于2015年底首次發(fā)布，其中生產(chǎn)工藝中使用的原料連二亞硫酸鈉，是一級遇濕易燃物品，在空氣中易氧化，同時發(fā)出刺激性酸味，與大多數(shù)氧化劑混合，具有爆炸危險性，因此生產(chǎn)過程對員工的安全保護要求較高[50]。隨著直接發(fā)酵生產(chǎn)天然紅曲黃色素技術(shù)水平的提高[51-55]，在適當?shù)臅r間可以對還原型紅曲黃色素國標(GB 1886.66—2015)進行修訂，補充直接發(fā)酵的天然紅曲黃色素生產(chǎn)工藝，使非轉(zhuǎn)化的天然紅曲黃色素生產(chǎn)與銷售合法化，推動天然安全性食品添加劑的發(fā)展。

3.1 生產(chǎn)原料及工藝改進

GB 1886.66—2015國家標準的使用范圍是以紅曲米作為原料，經(jīng)堿液洗脫，分離制得紅曲紅(或直接以紅曲紅為原料)，經(jīng)硫化物磺化、干燥制成的食品添加劑紅曲黃色素。然而，通過紅曲菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)、提取、濃縮、精制而成的或者以紅曲谷物為原料，經(jīng)過萃取、濃縮、精制直接得到的天然紅曲黃色素并不在此使用范圍內(nèi)。建議增加相關內(nèi)容，將直接發(fā)酵生產(chǎn)的天然紅曲黃色素納入其中，擴大GB 1886.66—2015國家標準的使用范圍，使天然紅曲黃色素得到認可。

3.2 產(chǎn)品形態(tài)改進

國家標準GB 1886.66—2015描述紅曲黃色素的狀態(tài)為“粉末”。有研究發(fā)現(xiàn)天然紅曲黃色素的穩(wěn)定性與所處的環(huán)境有關，并且在酸性條件下較穩(wěn)定，為提高天然紅曲黃色素穩(wěn)定性，一般將其儲存在酸性液體中。所以建議增加“糊狀”“液體”2種狀態(tài)的國家標準制定，提高紅曲黃色素的品質(zhì)，使紅曲色素產(chǎn)品形式多元化。

3.3 檢測鑒定方法改進

在鑒別試驗方面，GB 1886.66—2015描述紅曲黃色素的溶解性為“易溶于水”。天然紅曲黃色素可分為疏水性色素和親水性色素，且大部分為疏水性色素。大量研究表明，天然紅曲黃色素具有豐富的生物活性，所以應促進醇溶性色素的市場應用。因此，在檢測方法方面，應該對不同溶解性的紅曲黃色素設置不同的檢測方法，其中醇溶性色素應該使用乙醇溶液進行稀釋及色價分析。

GB 1886.66—2015紅曲黃色素色價的檢測標準為(476±10) nm。根據(jù)目前文獻報道，大部分天然紅曲黃色素的特征波長在330～450 nm的范圍內(nèi)[5, 14-15, 17, 20, 56]，而且具有不同特征波長的紅曲黃色素以不同比例混合時，最終產(chǎn)品的最大吸收波長會相應移動[57]。如果以GB 1886.66—2015規(guī)定的檢測波長檢測天然紅曲黃色素的色價，會造成部分產(chǎn)品的色價偏低，無法真實反應產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，建議使用分光光度計測定天然紅曲黃色素溶液在330～450 nm范圍內(nèi)的最大吸收峰，根據(jù)最大吸收峰的吸光值計算出色價。另外，GB 1886.66—2015規(guī)定色價大于或者等于100，這個規(guī)定可以在一定程度上保證產(chǎn)品的質(zhì)量，但也限制了一些具有豐富生物活性、色價偏低的天然紅曲黃色素產(chǎn)品的發(fā)展；參照“紅曲紅”國家標準(GB 1886.181—2016)中對色價的指標，建議將紅曲黃色素色價的指標改為“符合聲稱”。

4 結(jié)論

隨著天然紅曲黃色素生產(chǎn)技術(shù)的提高和發(fā)展，現(xiàn)有紅曲黃色素國家標準GB 1886.66—2015并不能代表先進的紅曲黃色素生產(chǎn)技術(shù)，相反會抑制天然紅曲黃色素的開發(fā)和潛在功能價值的發(fā)現(xiàn)。因此，建議在現(xiàn)有紅曲黃色素國家標準GB 1886.66—2015的基礎上，進行一定補充完善，從紅曲黃色素種類、使用范圍、感官要求、鑒別試驗、理化指標以及檢測方法等方面增加相關內(nèi)容，使直接發(fā)酵生產(chǎn)的非還原性天然紅曲黃色素合法化，促進紅曲黃色素產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，為社會提供新型安全的天然色素產(chǎn)品。