霉菌純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵中的成分變化及其與生物胺相關(guān)性的研究

劉敏，張仁鳳，陳光靜，宋軍，闞建全,3,4*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶,400715) 2(菽鄉(xiāng)(重慶)農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，重慶,400715) 3(中匈食品科學(xué)合作研究中心，重慶,400715) 4(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶,400715)

豆豉是以黃豆或大豆為主要原料，利用曲霉、毛霉或者細(xì)菌制曲產(chǎn)生的復(fù)雜酶系分解大豆中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)豆制品[1]，根據(jù)制曲時(shí)微生物不同分為細(xì)菌型、米曲霉型、毛霉型和根霉型豆豉等[2]。豆豉的制作主要有原料預(yù)處理、制曲、后發(fā)酵3個(gè)階段。在實(shí)際生產(chǎn)中后發(fā)酵分為2種類型：一種是制曲拌料后的豆豉坯放入大窖池或大陶缸或塑料大袋中密封在室溫下后熟，時(shí)間大約8個(gè)月及以上，是企業(yè)常用的后熟方式，稱為“傳統(tǒng)后發(fā)酵”或“傳統(tǒng)后熟”[3]，大多為毛霉型豆豉；一種是制曲拌料后，將豆豉坯放入大陶缸或塑料大袋中在較高溫度水浴或室內(nèi)溫度(40～60 ℃)下后熟，時(shí)間大約20～40 d，是現(xiàn)在部分企業(yè)采用的后熟方式，也將是發(fā)展的趨勢(shì)，稱之為“快速后發(fā)酵”或“快速后熟”，主要為米曲霉型豆豉。

生物胺(biogenic amines，BA)是一類具有生物活性的低分子含氮有機(jī)化合物的總稱，在食品中主要由氨基酸經(jīng)脫羧酶催化脫羧反應(yīng)產(chǎn)生。發(fā)酵豆豉滿足BA產(chǎn)生的3個(gè)條件：存在分泌氨基酸脫羧酶的微生物；存在對(duì)應(yīng)氨基酸；存在有利于微生物生長(zhǎng)且有助于分泌氨基酸脫羧酶的環(huán)境條件[4-7]。目前大多數(shù)企業(yè)仍然是利用多年形成優(yōu)勢(shì)菌群的曲房，采用自然接種方式制曲，微生物區(qū)系較復(fù)雜，造成產(chǎn)品中生物胺的含量較高且不穩(wěn)定，不同企業(yè)和同一企業(yè)不同批次產(chǎn)品中BA的含量也有較大的差異。研究發(fā)現(xiàn)，不同的制曲方式和發(fā)酵形式會(huì)影響豆豉中BA的類型和含量[8-9]。游離氨基酸大量存在于豆豉中，所以控制豆豉中生物胺含量的關(guān)鍵在于控制豆豉發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生生物胺的微生物的種類和數(shù)量，而有關(guān)純種制曲能否達(dá)到控制豆豉中生物胺含量的研究報(bào)道很少。

本課題組前期檢測(cè)出總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉、米曲霉2339、米曲霉41380、米曲霉40188 這6株試驗(yàn)菌株均產(chǎn)生酪胺，雅致放射毛霉和3株米曲霉能產(chǎn)生色胺，3株米曲霉能產(chǎn)生腐胺，而僅總狀毛霉具有組氨酸脫羧酶活性[10]?？梢?jiàn)，霉菌產(chǎn)生物胺的種類和含量無(wú)種屬特異性，但有菌株特異性，即同一種屬不同菌株產(chǎn)生物胺的能力各不相同，這還需要通過(guò)實(shí)際生產(chǎn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證說(shuō)明。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，永川毛霉型豆豉制曲中常用到的是總狀毛霉[11]，永川曲霉型豆豉制曲中常用的是米曲霉滬釀3.042(AspergillusoryzaeCICC 2339),具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)孢子量大、酶系豐富的特點(diǎn)[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用目前工業(yè)生產(chǎn)中最常見(jiàn)的總狀毛霉(MucorracemosusCICC 40481)和米曲霉滬釀3.042進(jìn)行純種制曲，采用“傳統(tǒng)后發(fā)酵”方式，研究其發(fā)酵中的動(dòng)態(tài)變化及與生物胺的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

黃豆(東北大豆)：購(gòu)自永輝超市。

發(fā)酵菌種：總狀毛霉(MucorracemosusCICC 40481)和米曲霉滬釀3.042(AspergillusoryzaeCICC 2339)，均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)。

1.1.2 主要試劑

BA標(biāo)準(zhǔn)品(純度均在98%以上)：腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、2-苯乙胺、組胺、酪胺，美國(guó)Sigma公司；苯甲酰氯，SIGMA公司；5’-磷酸吡哆醛、磷酸纖維素粉、二硫蘇糖醇、氨基胍硫酸鹽、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、L-賴氨酸、L-苯丙氨酸：分析純，BIOSHARP公司；甲醛(分析純)、甲醇(色譜級(jí))，成都科龍化工試劑廠提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(Agilent 1260)，美國(guó)Agilent公司；氨基酸自動(dòng)分析儀(L-8900)，日立(HITACHI)；臺(tái)式高速離心機(jī)(5810)，德國(guó)Eppendorf公司；電子天平(SQP)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；pH計(jì)(PB-10)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；可調(diào)式氮吹儀(PGC-21D)，京中諾遠(yuǎn)東公司；微型漩渦混合儀(MX-F)，上海瀘西分析儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(LRH-150F)，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DCX-9243 B-1)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器(KQ 3200DB)，昆山市超聲儀器有限公司；可調(diào)高速勻漿機(jī)(FS-2)，江蘇金壇科析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豆豉純種發(fā)酵的基本工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

(1)菌種培養(yǎng)：菌種在PDA培養(yǎng)基[13](馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min)試管中分別接種，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)3 d左右。選取菌體生長(zhǎng)良好的試管斜面，向試管中加入1 mL無(wú)菌水，振搖洗下培養(yǎng)基菌絲上的孢子，將制好的孢子懸液與麩皮培養(yǎng)基(麩皮與水質(zhì)量比1∶1混合，121 ℃高壓滅菌15 min)混合均勻，在三角瓶中于28 ℃下培養(yǎng)3 d，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，為防止培養(yǎng)基結(jié)塊，每隔5～6 h扣瓶1次。

(2)大豆篩選：選擇成熟充分、顆粒飽滿均勻、無(wú)霉?fàn)€變質(zhì)的黃豆。

(3)浸泡：大豆在40 ℃水中浸泡150 min，使大豆吸收一定水分至50%左右。

(4)蒸煮：常壓下2 h或0.14 MPa下蒸煮20～30 min。判斷標(biāo)準(zhǔn)：大豆外觀呈黃褐色，有豆香味，松散、柔軟、無(wú)硬心、不黏、無(wú)浮水。

(5)冷卻：室溫下冷卻至32 ℃。

(6)接種：接種量按大豆質(zhì)量的0.3%～0.5%計(jì)，把三角瓶中的種子菌與黃豆充分拌均勻。

(7)制曲：米曲霉28 ℃，3 d；毛霉15 ℃，5 d。

(8)拌料：按曲坯質(zhì)量計(jì)，在制好的曲料中拌入3%白酒(其酒精體積分?jǐn)?shù)為52%)、3%醪糟和12%食鹽，拌和均勻。

(9)傳統(tǒng)后發(fā)酵：將拌料后的曲料分裝至密封袋中，置于室溫下發(fā)酵。

(10)對(duì)照組的操作：篩選的大豆經(jīng)過(guò)浸泡、蒸煮、冷卻后，不接種任何菌種，按料的質(zhì)量計(jì)，在其中拌入3%白酒(其酒精體積分?jǐn)?shù)為52%)、3%醪糟和12%食鹽，拌和均勻。

1.3.3 待測(cè)豆豉樣品的制備

S1～S7是樣品的制曲階段， S8～S18分別代表了豆豉樣品在后發(fā)酵階段，詳見(jiàn)表1。

表1 后發(fā)酵階段Table 1 Stage of tradition post-fermentation

在S8～S18分別取樣，經(jīng)充分研磨后，進(jìn)行水分、總酸、pH值、氨基酸態(tài)氮、游離氨基酸、氨基酸脫羧酶活性及BA種類和含量的測(cè)定，并做3次平行試驗(yàn)。DZ表示對(duì)照組，MQ表示滬釀3.042組，ZZ表示總狀毛霉組。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 水分含量

采用GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》[14]直接干燥法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 pH值

取5.0 g待測(cè)樣品(含水量約45%)于50 mL離心管中，加20 mL蒸餾水并用勻漿機(jī)分散均勻，8 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至50 mL，用pH計(jì)測(cè)量上述定容溶液的pH值。

1.4.3 總酸

采用GB 12456—2008[15]《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法。

1.4.4 氨基酸態(tài)氮

采用GB 5009.235—2016[16]《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的酸度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 游離氨基酸

采用氨基酸自動(dòng)分析儀法[17]測(cè)定。準(zhǔn)確稱取豆豉樣品200 mg于10 mL塑料離心管中，加入2 mL 4%磺基水楊酸溶液，漩渦振蕩混勻，于4 ℃靜置15 h后，8 000 r/min離心10 min。取上清液過(guò)0.45 μm濾膜后上機(jī)分析測(cè)定。分析條件為：進(jìn)樣量20 μL；泵1流速0.4 mL/min；泵2流速0.35 mL/min；柱溫70 ℃；反應(yīng)器溫度135 ℃。

1.4.6 氨基酸脫羧酶活力的測(cè)定

參考ENDO的方法[18]。在37 ℃下，每1 h催化產(chǎn)生1 μmol BA的酶量，為1個(gè)活力單位(U)，氨基酸脫羧酶活性用1 g豆豉所具有的活力單位(U/g)來(lái)表示。

1.4.7 BA的檢測(cè)

參考胡鵬的方法[19]進(jìn)行樣品預(yù)處理，參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測(cè)定》[20]制備BA標(biāo)準(zhǔn)溶液，參考LIU等[21]的方法進(jìn)行BA測(cè)定的柱前衍生，參考并改進(jìn)SHUKLA的分析條件[22]進(jìn)行液相色譜，色譜柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A和B：超純水和甲醇；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃。進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 17.0和Origin 8.6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理和作圖，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3次，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。樣品中總酸、氨基酸、氨基酸態(tài)氮、生物胺的含量和氨基酸脫羧酶活性的數(shù)據(jù)都是標(biāo)準(zhǔn)化后統(tǒng)一到樣品水分含量為45%時(shí)的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌純種制曲豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中有關(guān)成分的變化

由圖1-a可知，DZ(對(duì)照)組、MQ(米曲霉)組和ZZ(總狀毛霉)組的豆豉在S8-S18過(guò)程中水分含量變化較小，說(shuō)明后發(fā)酵對(duì)水分含量的影響很小，而MQ與ZZ的水分差異應(yīng)該與它們?cè)诤蟀l(fā)酵過(guò)程中的消耗水分以及生物熱差異有關(guān)[23]。由圖1-b和圖1-c可知，在豆豉傳統(tǒng)后發(fā)酵(S8-S18)過(guò)程中，各組pH值均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且下降幅度MQ>ZZ>DZ；同時(shí)，MQ組和ZZ組的總酸含量逐漸增加(MQ>ZZ)，當(dāng)傳統(tǒng)后發(fā)酵進(jìn)行到末期，尤其是到達(dá)S17～S18時(shí)，pH值和總酸值波動(dòng)較小。這是由于在后發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)，依靠制曲期積累的酶的作用，將豆豉中的碳水化合物和脂肪以及蛋白質(zhì)分解成有機(jī)酸、脂肪酸及氨基酸，從而使總酸含量快速増加，pH值快速下降。而隨著發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步地延長(zhǎng)，發(fā)酵環(huán)境條件的改變，酶的催化反應(yīng)減弱，同時(shí)體系內(nèi)部的一些酸與醇類發(fā)生酯化反應(yīng)合成酯類，消耗部分酸使得總酸的含量趨于穩(wěn)定、pH值下降緩慢直到穩(wěn)定[24]。而與MQ組和ZZ組相比，DZ組由于沒(méi)有接種微生物進(jìn)行制曲，體系內(nèi)各種酶的數(shù)量較少，因此總酸含量增長(zhǎng)較為緩慢。3組樣品總酸值均小于2.5 g/100 g(以乳酸計(jì))，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

在后發(fā)酵階段，在微生物所分泌的蛋白酶等酶系作用下，蛋白質(zhì)水解成氨基酸和多肽，生成小分子肽、氨基酸及各種香氣的前體物質(zhì)，因此氨基酸態(tài)氮含量能反映出蛋白質(zhì)的水解程度。由圖1-d可知，在S8-S18階段，各組氨基酸態(tài)氮含量順序?yàn)镸Q>ZZ>DZ，這與豆豉發(fā)酵中MQ和ZZ產(chǎn)酶特性有關(guān)[24-25]，MQ生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的適宜條件為6.5～6.8，可產(chǎn)生酸性、中性、堿性蛋白酶。MQ組和ZZ組的氨基酸態(tài)氮含量在后發(fā)酵開(kāi)始的前30天(S8～S11)逐漸增加而后趨于平緩，這主要是由于后發(fā)酵前期各種酶活性都較高，但隨著后發(fā)酵的進(jìn)行，產(chǎn)生的有機(jī)酸增加，蛋白酶酶活力降低，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮的生成速率降低[26-27]。

圖1 霉菌純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中水分含量(a)、pH值(b)、總酸(c)和氨基酸態(tài)氮含量(d)變化Fig.1 The changes of water content (a), pH (b) and total acid (c), amino acid nitrogen content (d)of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

2.2 霉菌純種制曲豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中與BA相關(guān)的游離氨基酸的變化

游離氨基酸是BA形成的必備條件之一，在發(fā)酵過(guò)程中，蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下最終水解為游離氨基酸，游離氨基酸的生成大大提高了蛋白質(zhì)的消化率[28]。由表3可知，DZ組未接種微生物，該組的與BA相關(guān)的游離氨基酸含量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。而MQ組和ZZ組豆豉在后發(fā)酵中與BA相關(guān)的游離氨基酸含量普遍呈現(xiàn)出先快速增加，之后有所下降，這與王雪蒙等[29]的結(jié)果類似。這是由于后發(fā)酵初期在制曲階段積累的蛋白酶、水解酶等的活性較高，蛋白質(zhì)迅速水解促使游離氨基酸含量快速增加。隨著后發(fā)酵的進(jìn)行，MQ和ZZ在高滲透壓下無(wú)法產(chǎn)生大量蛋白酶，同時(shí)酸環(huán)境也導(dǎo)致水解蛋白質(zhì)的蛋白酶活力減弱[30]，因此游離氨基酸的生成速率降低，而發(fā)酵過(guò)程中BA生成以及美拉德反應(yīng)[31]都會(huì)消耗部分氨基酸，當(dāng)氨基酸的消耗速率大于生成速率時(shí)，豆豉中的游離氨基酸含量就減少了。

表3 霉菌純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵中游離氨基酸含量的變化Table 3 The changes of free amino acid content of mold starter-making Douchi duringtraditional post-fermentation

續(xù)表3

菌種組別編號(hào)游離氨基酸/(mg·kg-1)賴氨酸苯丙氨酸精氨酸組氨酸酪氨酸MQS82 198.80±12.21d2 870.63±20.99bc3 613.22±15.43d1 024.86±10.56c2 342.78±14.4fS92 850.53±22.39c3 958.65±12.31a4 013.59±18.60c1 453.02±9.73ab3 519.92±23.67dS102 775.64±22.98c3 944.19±22.00a5 639.43±19.45b1 354.42±10.22b3 685.42±14.49dS112 846.81±23.00c2 400.29±22.89c5 916.22±17.32a1 443.36±11.78ab3 020.07±14.22eS124 547.21±30.98a2 959.20±17.900b5 970.22±22.50a1 546.71±22.95a3 226.00±12.09eS134 547.19±29.52a3 022.26±19.22b6 077.96±23.94a1 498.36±12.43ab4 103.65±17.92cS144 345.50±29.87ab3 187.96±14.49b5 814.90±30.60ab1 311.91±14.33b3 216.25±15.98eS154 191.89±25.79b3 257.16±23.67b5 648.86±22.23b1 211.79±10.89bc4 439.60±22.69bS164 125.58±24.66b3 100.92±20.99b5 583.72±21.78b1 185.26±23.67c4 509.84±21.37aS174 181.67±25.12b3 090.01±15.67b5 680.20±26.99b1 111.96±10.09c4 190.60±33.25cS184 097.55±23.67b2 681.55±18.557c5 566.01±20.87b1 079.92±13.78c4 883.40±30.79aZZS8114.49±6.67f717.23±6.22d195.31±6.36f97.64±4.78e489.39±11.79fS9466.36±5.31e1 388.18±8.69b802.95±6.27e264.10±8.69d881.78±6.73eS101 158.69±10.49d1 930.60±8.55a1 773.30±10.68d428.11±8.11c1 237.53±9.42dS111 272.09±10.98d1 474.13±5.67b2 573.54±9.31c432.46±8.11bc928.08±11.35eS121 518.15±11.67c1 052.07±7.90c2 995.33±11.72a440.76±3.67bc923.51±10.31eS131 860.77±13.67a.1 965.34±11.38a3 165.96±16.89a566.22±8.66a1 359.84±12.89cS141 823.88±15.32a1 589.86±15.77b3 042.10±20.51ab547.57±5.77a1 547.93±13.73cS151 767.38±8.99bc2 167.06±18.26a2 732.87±22.98b533.68±5.59a2 221.82±15.42aS161 768.07±6.90bc2 032.05±10.58a2 761.04±14.78b454.08±5.81b1 077.35±10.56eS171 690.86±12.31c2 063.94±11.79a2 816.51±18.94b469.70±6.37b1 754.02±12.24bS181 742.56±13.57bc1 958.50±7.34a2 770.87±17.95b464.40±9.21b1 247.50±16.40d

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 霉菌純種制曲豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中與BA相關(guān)的氨基酸脫羧酶活力的變化

由表4可知，由于原料大豆在預(yù)處理時(shí)經(jīng)過(guò)蒸煮，同時(shí)未接種微生物，無(wú)氨基酸脫羧酶產(chǎn)生，所以DZ組豆豉在整個(gè)后發(fā)酵階段均未檢測(cè)出氨基酸脫羧酶活力。MQ組豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)到鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫羧酶活力，而ZZ組豆豉檢測(cè)出鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶活力，但其中鳥(niǎo)氨酸脫羧酶酶活變化較小(0.21～0.40 U/g)且低于MQ。這暗示了MQ組具有較強(qiáng)的腐胺與2-苯乙胺合成能力，而ZZ組具有腐胺和酪胺合成能力。結(jié)合表3，MQ，ZZ組的氨基酸在S8～S18期間先增加后減少，這應(yīng)該是蛋白質(zhì)水解生成氨基酸、氨基酸脫羧酶分解氨基酸、氨基酸參與色澤生成反應(yīng)3者共同作用的結(jié)果。

表4 霉菌純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中氨基酸脫羧酶活力的變化Table 4 The changes of amino acid decarboxylase activity of mold starter-making Douchi with duringtraditional post-fermentation

續(xù)表4

菌種組別編號(hào)氨基酸脫羧酶活力/(U·g-1)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶色氨酸脫羧酶苯丙氨酸脫羧酶組氨酸脫羧酶酪氨酸脫羧酶ZZS80.33±0.01bNDNDNDNDNDS90.31±0.02bNDNDNDND0.27±0.02cS100.40±0.01aNDNDNDND0.49±0.02aS110.37±0.01aNDNDNDNDNDS120.31±0.01bNDNDNDNDNDS130.33±0.00bNDNDNDNDNDS140.25±0.00dNDNDNDNDNDS150.30±0.00bcNDNDNDNDNDS160.29±0.01cNDNDNDND0.23±0.01dS170.21±0.01eNDNDNDND0.30±0.03bS180.24±0.02dNDNDNDND0.28±0.02bc

注：ND表示未檢出，下表同。

2.4 霉菌純種制曲豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中的BA變化

圖2是BA混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖，各BA的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5，MQ、ZZ純種制曲的豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中生物胺的變化見(jiàn)表6。

圖2 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of biogenic amines mixed standard solution

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 5 Linear equation and correlation coefficient ofthe standard curve

生物胺回歸方程相關(guān)系數(shù)R2線性范圍/(μg·L-1)保留時(shí)間/min腐胺y=101.45x+114.930.997 40.50～80.06.018尸胺y=70.003x+61.3110.998 50.50～80.06.875色胺y=52.319x+139.90.998 90.50～80.08.2212-苯乙胺y=51.88x+43.7240.999 30.50～80.09.601亞精胺y=69.215x+73.7830.996 10.50～80.010.249精胺y=72.624x+45.6210.998 40.50～80.013.523組胺y=24.692x-20.6640.997 30.50～80.014.990酪胺y=40.771x+92.0620.997 90.50～80.017.592

原料大豆DZ組未經(jīng)制曲階段，在整個(gè)后發(fā)酵過(guò)程中仍含腐胺、尸胺、亞精胺和精胺4種BA，和本文類似，QIU等[32]在煮熟的豆?jié){、豆腐中也發(fā)現(xiàn)了生物胺；KALAC等[33]發(fā)現(xiàn)大豆中含有較高的精胺和亞精胺。MQ組豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵前期含腐胺、2-苯乙胺、亞精胺和精胺，但隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，僅檢測(cè)出腐胺和2-苯乙胺2種BA；整個(gè)后發(fā)酵過(guò)程中，其腐胺含量變化不大(46.10～57.73 mg/kg)，而2-苯乙胺含量由ND增加到222.04 mg/kg，已超過(guò)歐盟規(guī)定的2-苯乙胺限量標(biāo)準(zhǔn)(2-苯乙胺<30 mg/kg)[34]；ZZ組豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中含腐胺、亞精胺和酪胺3種BA，其中腐胺含量變化較小(8.35～11.63 mg/kg)，亞精胺逐漸減少，而酪胺則呈逐漸增加的趨勢(shì)，這可能與BA的代謝中存在BA之間的相互轉(zhuǎn)換有關(guān)，例如腐胺、亞精胺和精胺這3種BA就可以互相轉(zhuǎn)換[35]。表6中MQ組的2-苯丙胺、ZZ組的酪胺增加也與表4檢測(cè)出的MQ組的苯丙氨酸脫羧酶活力、ZZ組的酪氨酸脫羧酶活力有關(guān)。

表6 霉菌純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中生物胺的變化Table 6 The changes of biogenic amines of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

續(xù)表6

菌種組別編號(hào)生物胺/(mg·kg-1)PUTCADPHESPDSPMHISTYRTBAMQS1352.36±1.69bND144.35±6.78bNDNDNDND196.71±7.99cS1449.89±2.35cND214.75±2.83aND4.31±0.29aNDND268.95±4.89abS1557.73±0.83aND222.04±8.54aNDNDNDND279.77±7.96aS1651.04±0.89bND219.09±1.84a0.53±0.11b1.93±0.06cNDND272.59±6.90aS1748.32±0.31cND209.42±8.98aNDNDNDND257.74±3.56bS1846.10±0.86cND207.70±11.21aNDNDNDND253.80±10.66bZZS811.51±0.46aNDND5.29±0.23cNDNDND16.80±1.35eS910.92±0.30abNDND7.87±0.28bNDND15.22±0.47d34.01±3.65dS1011.63±0.27aNDND9.17±0.35aNDND19.76±0.72c40.56±4.89cS1110.48±0.51bNDND9.76±0.13aNDND16.75±0.31d36.99±3.89dS1211.56±0.17aNDND2.82±0.20dNDNDND14.38±2.77fS1310.33±0.27bNDND2.91±0.27dNDNDND13.24±1.28fS148.77±0.12cNDND2.41±0.31dNDNDND11.18±0.98fS1511.10±0.05aNDNDNDNDNDND11.10±2.11fS1610.73±0.41bNDNDNDNDND27.15±3.96c37.88±3.46dS178.90±0.00cNDND1.72±0.13eNDND45.39±2.13b56.01±4.55bS188.35±0.14cNDND1.95±0.25eNDND63.68±4.76a73.98±4.98a

注： CAD：尸胺； HIS：組胺； PHE：苯乙胺；PUT：腐胺； TRP：色胺；SPM：精胺；SPD：亞精胺； TYR：酪胺；TBA：總生物胺，下圖同。

由圖3可以看出，通過(guò)S8和S18對(duì)比，DZ組的BA種類未發(fā)生變化，總生物胺(total biogenic amine, TBA)含量只降低了5.53%(表6)；MQ組的BA種類由S8的腐胺、亞精胺和精胺，變?yōu)镾18的腐胺和2-苯乙胺，TBA含量增加了3.05倍(表6)；ZZ組的BA種類也發(fā)生變化，S18與S8的腐胺、亞精胺相比，新增加了酪胺，其TBA含量增加了3.40倍。MQ的TBA隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷累積增加，ZZ組的BA含量隨發(fā)酵進(jìn)行先增加后降低再增加，整個(gè)后發(fā)酵過(guò)程中ZZ的TBA遠(yuǎn)小于MQ，說(shuō)明采用ZZ進(jìn)行純種制曲在傳統(tǒng)后發(fā)酵要優(yōu)于MQ；此外，調(diào)整后發(fā)酵時(shí)間也能達(dá)到控制BA目的。從表3來(lái)看，MQ組在各時(shí)間段的游離氨基酸含量均遠(yuǎn)高于DZ和ZZ，從側(cè)面說(shuō)明米曲霉發(fā)酵豆豉時(shí)產(chǎn)生水解蛋白質(zhì)的酶系豐富或者產(chǎn)酶量更大，給生物胺合成提供更多的反應(yīng)物，導(dǎo)致了豆豉中更高的生物胺含量，從表4看出，MQ檢測(cè)出的氨基酸脫羧酶活力也明顯高于ZZ，說(shuō)明MQ的生物胺合成能力更強(qiáng)。這結(jié)果與豆豉實(shí)際生產(chǎn)的“毛霉型豆豉常是傳統(tǒng)后發(fā)酵方式，米曲霉豆豉常是快速后發(fā)酵方式”是一致的。

圖3 霉菌純種制曲豆豉傳統(tǒng)后發(fā)酵始末生物胺含量的對(duì)比Fig.3 Comparison of biogenic amines of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

2.5 霉菌純種制曲豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中與BA相關(guān)的游離氨基酸與BA含量間的相關(guān)性分析

圖4 霉菌純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中與BA相關(guān)的游離氨基酸與生物胺含量間的相關(guān)性分析Fig.4 Relativity analysis between free amino acid and biogenic amine content of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation

表7 霉菌純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)的相關(guān)性(R)矩陣表Table 7 Correlation of parameters of mold starter-making Douchi during traditional post-fermentation process

組別水分pH值總酸氨基酸態(tài)氮PUTCADSPDSPMTBADZ水分1-0.1720.1800.0550.197-0.1570.2750.3480.254pH值1-0.965??-0.879??0.1600.868??-0.098-0.0080.185總酸10.926??-0.168-0.893??0.022-0.052-0.254氨基酸態(tài)氮1-0.219-0.829??-0.170-0.179-0.397PUT10.3900.2570.6010.601CAD10.1590.3430.508SPD10.723?0.877??SPM10.892??TBA1水分pH值總酸氨基酸態(tài)氮PUTPHESPDSPMTBAMQ水分10.432-0.365-0.3700.310-0.4500.4360.342-0.438pH值1-0.932??-0.904??0.175-0.986??0.831??0.832??-0.979??總酸10.884??0.0690.935??-0.777??-0.786??0.942??氨基酸態(tài)氮1-0.0340.871??-0.603?-0.621?0.882??PUT1-0.0890.0250.084-0.049PHE1-0.855??-0.836??0.998??SPD10.889??-0.829??SPM1-0.813??TBA1水分pH值總酸氨基酸態(tài)氮PUTSPDTYRTBAZZ水分1-0.5390.4650.579-0.077-0.2000.1870.146pH值1-0.972??-0.940??0.651?0.797??-0.505-0.302總酸10.964??-0.613?-0.822??0.4170.171氨基酸態(tài)氮1-0.642?-0.678?-0.5050.274PUT10.362-0.623?-0.511SPD1-0.1850.076TYR10.945??TBA1

注：** 表示在0.01水平上呈極顯著性相關(guān)，*表示0.05水平上呈顯著性相關(guān)。

根據(jù)相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值|r|的大小可以將相關(guān)關(guān)系大致分為5類：0.8～1.0為極強(qiáng)相關(guān)，0.6～0.8為強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.6為中等程度相關(guān)，0.2～0.4為弱相關(guān)，0.0～0.2則可以視為極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)[36]。由圖4可知，苯丙氨酸含量和2-苯乙胺含量間為弱相關(guān)性，而精氨酸含量與亞精胺呈強(qiáng)的負(fù)相關(guān)(皮爾遜系數(shù)r分別為-0.770 9，P<0.01)，精氨酸含量與精胺含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(皮爾遜系數(shù)r為-0.947 8，P<0.01)，腐胺與鳥(niǎo)氨酸之間的相關(guān)性由于鳥(niǎo)氨酸的未檢出而無(wú)法確定。

2.6 霉菌純種制曲豆豉在后發(fā)酵過(guò)程中有關(guān)成分與BA的相關(guān)性分析

對(duì)純種制曲豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中的水分含量、pH值、總酸和氨基酸態(tài)氮含量與BA含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表7所示。豆豉在傳統(tǒng)后發(fā)酵期間水分含量變化很小，3組豆豉水分含量與各BA間無(wú)相關(guān)性。MQ組中，pH值與精胺和亞精胺呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，ZZ組中，pH值與腐胺有顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)、與亞精胺有極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；總酸含量/BA的相關(guān)性與pH值/BA相關(guān)性恰好相反。這表明在一定的酸性環(huán)境中(pH 5.5～6.6)，低pH(總酸含量高)對(duì)MQ、ZZ產(chǎn)生這些BA具有抑制作用，這可能是因?yàn)榈蚿H值(總酸含量高)在一定程度上影響了菌的活性，這與吳燕燕等[37]的研究結(jié)果類似。大多數(shù)研究表明氨基酸態(tài)氮與BA之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系[38-39]，表7顯示在MQ組中，氨基酸態(tài)氮含量TBA呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，但在ZZ組中，氨基酸態(tài)氮含量與TBA的相關(guān)性不顯著。

3 結(jié)論

在傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中，各試驗(yàn)組豆豉水分含量均基本保持不變；總酸、氨基酸態(tài)氮、相關(guān)游離氨基酸含量先增加后穩(wěn)定，而pH值先迅速下降后穩(wěn)定。

對(duì)照組豆豉檢出腐胺、尸胺、亞精胺和精胺4種生物胺，且保持穩(wěn)定；米曲霉組豆豉最終檢出腐胺和2-苯乙胺，總狀毛霉組豆豉最終檢出了腐胺、亞精胺和酪胺。米曲霉組和總狀毛霉分別具有苯丙氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶活力，二者都有鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活力。

傳統(tǒng)后發(fā)酵過(guò)程中，水分與生物胺之間無(wú)相關(guān)性；而pH值和總酸與腐胺、亞精胺、精胺、總生物胺存在顯著相關(guān)性(P<0.05)；僅有米曲霉組豆豉的氨基酸態(tài)氮含量與總生物胺呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。精氨酸與亞精胺、精胺都出現(xiàn)了極顯著相關(guān)(P<0.01)，而苯丙氨酸含量和2-苯乙胺含量間為弱相關(guān)性。