CRISPR/Cas9技術(shù)在節(jié)肢動物中的應(yīng)用研究

黃津偉 胡樂貞 齊佳辰 孫金生 李冉

摘要 CRSPR/Cas9系統(tǒng)是基于RNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中。其特點(diǎn)在于單個蛋白質(zhì)Cas9與兩個短RNA序列結(jié)合后，可作為位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶在體內(nèi)或體外發(fā)揮作用。與傳統(tǒng)的由核酸酶介導(dǎo)的DNA編輯技術(shù)不同，CRISPR/Cas9對DNA的識別不是由蛋白質(zhì)指定的，而是由 20-nt向?qū)NA（guide RNA）序列指定的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于其設(shè)計(jì)過程和使用過程簡單高效而被廣泛應(yīng)用?？偨Y(jié)CRSPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)理、導(dǎo)入方法及其在節(jié)肢動物中不同類群及不同基因的應(yīng)用進(jìn)展，以期為重要農(nóng)業(yè)及經(jīng)濟(jì)節(jié)肢動物的功能基因研究與遺傳育種研究提供有價(jià)值的參考。

關(guān)鍵詞 CRISPR/Cas9;導(dǎo)入方法;節(jié)肢動物;基因編輯

中圖分類號 Q78? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0001-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.001

Research on the Application of CRISPR/Cas9 Technology in Arthropods

HUANG Jin-wei， HU Le-zhen， QI Jia-chen et al

（College of Life Sciences，Tianjin Normal University， Tianjin 300387）

Abstract The CRISPR/Cas9 system is an RNA-based adaptive immune system which exists in bacteria and archaea. Its characteristic is that following the compound of a single protein Cas9 with two short RNA， it can act as a site-specific endonuclease in vivo/in vitro. Unlike traditional nuclease-mediated DNA editing technology， the recognition of DNA by CRISPR-Cas9 is not specified by the protein， but by the 20-nt guide RNA （guide RNA） sequence. The CRISPR-Cas9 system is widely used due to its simplicity in design， use and high efficiency. Summarizes the mechanism of CRSPR/Cas9 system， the introduction method and the application progress of different groups and different genes in arthropods， in order to provide a valuable reference for the research of functional genes and genetic breeding of important agricultural and economic arthropods.

Key words CRISPR/Cas9;Introducing method;Arthropod;Gene editing

基金項(xiàng)目 “藍(lán)色糧倉”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題（2018YFD0901301）。

作者簡介 黃津偉（1997—），女，天津人，碩士研究生，研究方向：水生生物學(xué)。

通信作者，孫金生，研究員，從事重要水產(chǎn)動物疾病的發(fā)生和免疫防治研究;李冉，副教授，從事重要水產(chǎn)動物生長生理及分子育種研究。

收稿日期 2021-08-01;修回日期 2021-08-23

基因組編輯技術(shù)是研究各種生物體靶基因功能的有效手段，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)之前，鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術(shù)常用于基因編輯，這2種技術(shù)均可用于設(shè)計(jì)DNA結(jié)合域，可以有效地識別和修改基因序列，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。然而鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶需要使用多種核酸酶，核酸酶的脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致細(xì)胞毒性，且使用方法較為復(fù)雜[1]，因此這2個基因組編輯系統(tǒng)最近被CRISPR/Cas9系統(tǒng)取代。CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯簡單高效，已被廣泛用于哺乳動物。

節(jié)肢動物物種繁多，包括與農(nóng)林漁業(yè)相關(guān)的諸多物種，了解相關(guān)物種的基因功能從而在農(nóng)林漁業(yè)中合理應(yīng)用是非常重要且必要的。CRISPR/Cas9已應(yīng)用于節(jié)肢動物的部分物種，筆者對已成功應(yīng)用的物種及研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為重要農(nóng)業(yè)及經(jīng)濟(jì)節(jié)肢動物的功能基因研究與遺傳育種研究提供有價(jià)值的參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas的作用機(jī)理及類型

CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR associate proteins）系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌內(nèi)，是以RNA為基礎(chǔ)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，主要防御外來核酸的侵染，維持細(xì)菌自身正常生命代謝活動[2]。CRISPR/Cas系統(tǒng)由反式激活CRISPR RNA基因（tracrRNA）、Cas操縱子和CRISPR DNA區(qū)域3部分組成，其中CRISPR由一組重復(fù)間隔序列及多個非重復(fù)間隔序列組成，非重復(fù)間隔序列是早先侵入細(xì)菌內(nèi)的病原體核酸片段經(jīng)過不斷進(jìn)化形成的。tracrRNA作為一種獨(dú)特的非編碼RNA，與CRISPR間隔序列具有同源性。Cas操縱子目前已發(fā)現(xiàn)有多種，如Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，可經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯生成Cas蛋白（核酸酶）。當(dāng)侵染過的病毒再次入侵細(xì)胞，CRISPR DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄生成前體CRISPR RNA（pre-crRNA），tracrRNA與pre-crRNA通過堿基互補(bǔ)配對及RNA酶的作用形成成熟的crRNA[3]。crRNA與tracrRNA組成單鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA），并利用細(xì)菌中的核酸酶進(jìn)一步修飾crRNA的5′端，使其長度最終減少到20 nt。當(dāng)crRNA下游存在特定的前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）時(shí)，Cas蛋白將被引導(dǎo)至入侵病原體DNA與crRNA互補(bǔ)的位點(diǎn)處進(jìn)行切割，完成免疫過程?；谏鲜鲞^程，有研究者提出可以在體外合成sgRNA模擬體內(nèi)crRNA和tracrRNA的結(jié)構(gòu)，并與Cas9結(jié)合形成CRISPR/Cas9系統(tǒng)。Jinek等[4-5]研究出利用sgRNA對特定DNA進(jìn)行剪切的核酸酶系統(tǒng)，首次證明了CRISPR/Cas9可以被應(yīng)用于基因工程。Mali等[6-7]創(chuàng)建CRISPR/Cas9系統(tǒng)并應(yīng)用于基因編輯。由于其設(shè)計(jì)使用較為簡單且有效，CRISPR/Cas系統(tǒng)得到了生物學(xué)屆和醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，并廣泛應(yīng)用于基因編輯、轉(zhuǎn)錄擾動、表觀遺傳調(diào)節(jié)和基因組成像等相關(guān)研究[8]。根據(jù)目前CRISPR/Cas位點(diǎn)的分類[9]，CRISPR系統(tǒng)被分為6種不同的類型（I～VI），各類型都使用特定的Cas蛋白和crRNA。相比其他系統(tǒng)來說，II型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)最簡單，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

1.2 CRISPR/Cas9的修復(fù)機(jī)制

Cas9蛋白包含2個結(jié)構(gòu)域，其中HNH結(jié)構(gòu)域可剪切與sgRNA互補(bǔ)的靶DNA鏈（目標(biāo)鏈），RuvC結(jié)構(gòu)域則剪切另外一條核酸鏈，造成目標(biāo)DNA的雙鏈斷裂（double-strand DNA break，DSB）。雙鏈斷裂后細(xì)胞內(nèi)會啟動修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞在不同的分裂時(shí)期會啟動不同的修復(fù)機(jī)制。每個細(xì)胞分裂時(shí)期都可以發(fā)生非同源修復(fù)機(jī)制（nonhomologous end joining，NHEJ），這種機(jī)制不需要同源模板存在。DNA雙鏈斷裂后修復(fù)酶會對斷裂末端進(jìn)行酶切修飾，便于DNA連接酶將斷裂的兩端DNA重新連接在一起，這種修復(fù)方式易在斷裂位點(diǎn)出現(xiàn)堿基插入或缺失，且通常會產(chǎn)生移碼突變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的提前終止，轉(zhuǎn)錄物降解或蛋白質(zhì)丟失。另一種細(xì)胞修復(fù)機(jī)制只能發(fā)生在細(xì)胞分裂間期，它需要同源修復(fù)模板，稱為同源修復(fù)機(jī)制（homology-directed repair，HDR），模板可以是ssDNA或dsDNA，在導(dǎo)入CRISPR/Cas9的同時(shí)，需要提供帶同源臂的供體DNA作為整合模板，其可以攜帶外源DNA序列從而引入新的基因。CRISPR/Cas9系統(tǒng)也是當(dāng)前應(yīng)用最多的系統(tǒng)可以利用非同源修復(fù)機(jī)制使目的基因轉(zhuǎn)錄失敗或使目的蛋白失去功能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因敲除，在哺乳動物中的成功率較高，Cas9中的HNH結(jié)構(gòu)域可以利用多個sgRNA通過非同源修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)一個試驗(yàn)中多個靶基因（序列較短）的突變[7，10]，也可通過引入2個sgRNA敲降較長的基因組片段。

1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的導(dǎo)入方法

1.3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的封裝方式。

目前導(dǎo)入CRISPR/Cas9的方式有很多，分別可以mRNA、DNA、蛋白-核酸的形式引入。在RNA水平上，2015年Hruscha等[11]將sgRNA和Cas9 mRNA通過顯微注射導(dǎo)入到斑馬魚胚胎中，對斑馬魚基因組進(jìn)行編輯;在DNA水平上，主要通過質(zhì)?；虿《窘閷?dǎo)DNA導(dǎo)入;在蛋白質(zhì)-核酸水平上，通常在體外表達(dá)Cas9蛋白，并與sgRNA孵育結(jié)合形成Cas9蛋白-sgRNA復(fù)合體后將其導(dǎo)入受精卵或細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯[12-13]。

1.3.2 顯微注射法。

顯微注射法是將外源基因?qū)肱咛サ淖畛Ｒ娗易钪苯拥姆椒?，在?jié)肢動物的模式生物中應(yīng)用較為廣泛，也是當(dāng)下CRISPR/Cas9導(dǎo)入的主要技術(shù)。但顯微注射技術(shù)仍在應(yīng)用方面存在一些阻礙：例如部分節(jié)肢動物的卵膜會在排卵后很快變硬導(dǎo)致在注射時(shí)胚胎破裂，由于卵細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不同造成注射時(shí)內(nèi)容物的外流等。目前研究人員針對不同情況已經(jīng)提出了相應(yīng)的解決方法，對于卵膜硬化問題，解決的方法是選擇合適的時(shí)間，在產(chǎn)卵后應(yīng)立即收集胚胎，將卵置于某些試劑（如蔗糖、次氯酸鹽）中[13-14]或置于冰上，防止卵膜變硬;而對于卵細(xì)胞滲透壓差異問題，平衡滲透壓是最有效的解決方法，海洋動物的卵或胚胎可以放在海水中[15];探索合適的培養(yǎng)條件，如Hiruta等[16]提出水蚤中分離的胚胎培養(yǎng)于2%瓊脂、60 mmol/L蔗糖的培養(yǎng)基上最有利于顯微注射。雖然顯微注射技術(shù)目前應(yīng)用得相對廣泛，但由于需要精密昂貴的注射設(shè)備、高難度的操作技術(shù)且成活率較低，研究者們在積極探求更優(yōu)的技術(shù)方法。

1.3.3 精子介導(dǎo)法。

1971年首次報(bào)道了精子能攜帶異源基因整合到受精卵中[17]，1989年Lavitrano等[18]將外源DNA與小鼠精子在等滲溶液中孵育15 min，在后代中檢測出外源基因被帶入受精卵，證明精子細(xì)胞具有吸收外源DNA并將其攜帶到卵細(xì)胞的能力。但是，由于精子是成熟的生殖細(xì)胞，無法在分裂之前選擇成功整合外源DNA的細(xì)胞，即使精子進(jìn)入卵細(xì)胞后在受精卵或子一代中成功轉(zhuǎn)入外源基因，也可能是以染色體外形式存在，而不是整合到宿主基因組中[19]。2008年Wu等[20]將109個精子和50～300 mg DNA在體外17 ℃孵育，后經(jīng)人工授精，檢測到仔豬存在轉(zhuǎn)基因個體，但70～90 d齡的仔豬均未檢測到外源DNA，表明精子攝取DNA僅在早期傳遞給后代，研究人員推測是由于早期細(xì)胞分裂復(fù)制過程導(dǎo)致外援DNA丟失。為了優(yōu)化精子介導(dǎo)法，研究者進(jìn)行了多種嘗試，例如使用線性化質(zhì)粒[18]、通過轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化DNA轉(zhuǎn)移[21]，并且發(fā)現(xiàn)精子攝取DNA效率與精子的運(yùn)動性高度相關(guān)[20]。目前精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已經(jīng)在小鼠[22-23]、牛[24-25]、豬[23]、雞[26-27]、魚類等生物中得到一定改良和應(yīng)用，2014年Xin等[28]發(fā)現(xiàn)海洋魚類精子由于精漿中存在DNA酶，攝取外源DNA能力較弱，可通過除去精漿并用脂質(zhì)體包裝DNA的方法實(shí)現(xiàn)精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。精子介導(dǎo)法有操作簡便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，通過精子介導(dǎo)CRISPR/Cas9到節(jié)肢動物的受精卵或胚胎也作為引入CRISPR/Cas9的可行性方法受到研究者的關(guān)注，但在節(jié)肢動物中尚未報(bào)道。

1.3.4 納米顆粒介導(dǎo)法。

用納米顆粒包裝CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞可以增大體內(nèi)細(xì)胞對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的內(nèi)化率，克服離體基因編輯的限制，為內(nèi)容物分子提供屏障以防止降解，還可通過設(shè)計(jì)納米顆粒的結(jié)構(gòu)和成分，靈活實(shí)現(xiàn)靶向特定的組織。CRISPR/Cas9進(jìn)入細(xì)胞的3種方式產(chǎn)生的復(fù)合物與質(zhì)粒均可以被納米顆粒包裝進(jìn)入細(xì)胞[29-31]。對于通過納米顆粒包裝CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞來說，以Cas9 mRNA和sgRNA混合物的方式進(jìn)行包裝優(yōu)于Cas9-sgRNA質(zhì)粒包裝，原因在于質(zhì)粒DNA中包含了大量非編碼序列，長度較大，使得包裝難度高[32]。此外，mRNA可以直接在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯，不需整合到宿主基因組中，沒有插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)，脫靶率較低，質(zhì)粒則需要進(jìn)入細(xì)胞核中完整進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。當(dāng)前各種納米顆粒的應(yīng)用有很多，例如兩性離子氨基脂質(zhì)（zwitterionic amino lipids，ZALs）納米顆粒[33]、外泌體-脂質(zhì)體雜合納米顆粒[34]、脂質(zhì)納米顆粒[35]和陽離子類脂質(zhì)納米顆粒[36-37]等都實(shí)現(xiàn)了遞送CRISPR/Cas9進(jìn)入細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)基因編輯。但由于納米顆粒傳導(dǎo)法前期制備方法復(fù)雜、成本較高，因而在一定程度上限制了其在基因編輯操作中的廣泛應(yīng)用。

1.3.5 病毒介導(dǎo)法。

以病毒為載體導(dǎo)入CRISPR/Cas9主要用到的是慢病毒（lentivirus）、腺病毒（adenovirus）和腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）。慢病毒可以將外源DNA整合到宿主染色體中，形成穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系，但毒性較大，感染效果較差。腺病毒感染效果好，但免疫原性高、維持時(shí)間短。目前比較成熟的是腺相關(guān)病毒，它的免疫原性低，并且有多種血清型可以靶向不同的器官或組織，但是AAV的裝載能力比較差，需要構(gòu)建雙載體進(jìn)行導(dǎo)入。研究中用的比較多的是釀膿鏈球菌Cas9（spCas9，～4.2 kb）。例如Ran等用來自金黃色葡萄球菌的Cas9蛋白（saCas9，～3.2 kb）代替spCas9，從而將sgRNA和Cas9構(gòu)建于一個載體中[38-39]。以上3種病毒介導(dǎo)CRISPR/Cas9進(jìn)入細(xì)胞或胚胎的技術(shù)較為成熟，但是它們只能侵染哺乳動物，無法感染節(jié)肢動物，因此無法應(yīng)用于節(jié)肢動物轉(zhuǎn)基因工作。目前廣泛應(yīng)用于節(jié)肢動物轉(zhuǎn)基因工作的病毒載體是桿狀病毒（baculovirus）[40]。Zhu等[41]通過磁性納米粒子-桿狀病毒載體（MNP-BVs），在磁場的作用下介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)靶向基因編輯。Dong等[42]構(gòu)建桿狀病毒誘導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)入昆蟲細(xì)胞，在很大程度上降低了脫靶效應(yīng)。Naik等[43]研究發(fā)現(xiàn)加州苜蓿多核多角體病毒（AcMNPV）可以有效地介導(dǎo)外源基因進(jìn)入蚊子細(xì)胞，通過合適的啟動子誘導(dǎo)高效表達(dá)基因，而且對細(xì)胞繁殖和生存力沒有明顯消極影響。對于基因組信息尚未解析的物種，無法確定高效啟動外源基因表達(dá)的啟動子，因此在這些物種中使用病毒介導(dǎo)外源基因的技術(shù)還不成熟。

1.3.6 卵黃蛋白原介導(dǎo)法。

大多數(shù)卵生動物雌性在卵巢發(fā)育的過程中會向卵細(xì)胞中輸送蛋白質(zhì)，其中最重要的是卵黃蛋白的輸入。在昆蟲和其他節(jié)肢動物中，卵黃蛋白前體（yolk protein precursors，YPPs）在脂肪體中合成，分泌到血淋巴，并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入卵巢。在卵黃發(fā)生過程中，卵母細(xì)胞膜上有多個受體，并與YPP配體結(jié)合，這些配體被內(nèi)吞進(jìn)入小泡中，并被分選為卵黃顆粒，為發(fā)育中的胚胎儲存營養(yǎng)物質(zhì)[44]。Chaverra-Rodriguez等[44]發(fā)現(xiàn)節(jié)肢動物卵黃蛋白原前體的配體可以與Cas9整合成重組蛋白，從而將Cas9-sgRNA帶入卵內(nèi)?？梢酝ㄟ^將與CRISPR系統(tǒng)整合的卵黃蛋白原前體注射到甲殼動物的血淋巴中，同時(shí)引入胞漿的內(nèi)吞小泡釋放劑（主要為氯奎、皂素），防止進(jìn)入的復(fù)合物局限于小泡而不被釋放導(dǎo)致基因編輯成功率降低，使用這種方法進(jìn)行基因編輯的編輯效率為30%。該方法操作要求低，目前已成功應(yīng)用于麗蠅蛹集金小蜂、斯氏按蚊等物種[45-46]。

1.3.7 電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)法。

電穿孔傳導(dǎo)法是利用電場震動細(xì)胞，使細(xì)胞膜出現(xiàn)孔道，流動性增加，從而使帶電的外源基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)移[2，47]。DNA或其他帶電分子通過高電壓在細(xì)胞膜上制造暫時(shí)的穿孔進(jìn)入細(xì)胞，可以通過這些小孔。在一次電穿孔試驗(yàn)中可以有多個胚胎同時(shí)作為試驗(yàn)材料，相比顯微注射有更高的效率。但對于體內(nèi)基因編輯來說，電穿孔會對細(xì)胞造成損傷，當(dāng)下主要將其用于體外基因編輯研究中。在嚙齒動物中已使用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入CRISPR系統(tǒng)并成功完成基因編輯[48-50]。根據(jù)試驗(yàn)物種特異性，不同的物種適用于不同的傳遞方法，也可以同時(shí)應(yīng)用2種導(dǎo)入方法來增加基因編輯的成功率[51]。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在節(jié)肢動物中的應(yīng)用

節(jié)肢動物包括的物種眾多，與農(nóng)業(yè)、林業(yè)、漁業(yè)、公共衛(wèi)生等領(lǐng)域密切相關(guān)。因此將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于節(jié)肢動物會為人類社會創(chuàng)造極大的價(jià)值。

2.1 甲殼動物中的應(yīng)用

2.1.1 水蚤。

水蚤（Daphnia）的研究歷史非常深遠(yuǎn)，在水生食物鏈中占有重要地位。在水生毒理學(xué)和對環(huán)境的適應(yīng)性影響，使其成為環(huán)境、生態(tài)、進(jìn)化和發(fā)展基因組學(xué)研究的重要模型。水蚤的完整基因組于2011年測序完成[52]，為研究甲殼動物基因功能和CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

2.1.1.1 建立基因編輯模型。

2014年Nakanishi等[53]首次報(bào)道CRISPR/Cas9在大型蚤（Daphnia magna）中成功突變無眼基因（eyeless）。通過顯微注射將Cas9 mRNA和sgRNA導(dǎo)入受精卵中，后代有18%～47%眼部出現(xiàn)異常，成熟后眼睛變形率高達(dá)8.2%。Kumagai等[54]通過顯微注射將Cas9/gRNA核糖核酸蛋白（RNPs）注入水蚤受精卵中，發(fā)現(xiàn)D.magna中包含純化的Cas9蛋白和gRNA的Cas9 RNP的切割活性，后將Cas9蛋白與無眼基因gRNA一起溫育并注射到D.magna卵中，得到典型的無眼突變體表型。Hiruta等[55]組裝靶向Distal-less基因（Dll）的sgRNA，該基因是編碼無脊椎動物和脊椎動物遠(yuǎn)端肢體發(fā)育必不可少的同源域轉(zhuǎn)錄因子，研究者將Cas9 RNP顯微注射至淡水枝角水蚤（Daphnia pulex）受精卵中，注射的胚胎顯示出第二觸角的形成缺陷和附肢的發(fā)育紊亂，在Dll基因座中檢測到插入缺失突變。此外，DapmaSt是大型蚤（D.magna）眼睛中黑色素沉著必須的基因，因此常被選來作為大型蚤的顏色標(biāo)記基因，Ismail等[56]通過顯微注射Cas9 mRNA和靶向DapmaSt的sgRNA，建立了眼點(diǎn)白化的DapmaSt突變株。

2.1.1.2 5-羥色胺影響的信號通路。

5-羥色胺具有調(diào)節(jié)動物的發(fā)育、生長、繁殖和行為的關(guān)鍵功能。Campos等[57]在水蚤（Daphnia magna）中通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別構(gòu)建了5-羥色胺（Tryptophan hydroxylase，TRH）單等位基因和雙等位基因缺失的突變體，與野生型個體相比單等位基因突變體生長更慢、繁殖更晚，雙等位基因突變體變型更顯著。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能基因分析顯示TRH突變體的生長、蛻皮和能量代謝信號通路基因都出現(xiàn)下調(diào)，缺少5-羥色胺的雙等位基因突變體呈現(xiàn)出5-羥色胺酸突觸和花生四烯酸的代謝途徑被下調(diào)，色氨酸至犬尿氨酸代謝途徑中的基因被上調(diào)表達(dá)，從而表明了5-羥色胺酸與花生四烯酸的代謝途徑之間存在相互作用關(guān)系，對胰島素生長因子介導(dǎo)的信號通路的影響很小[58]。

2.1.1.3 選擇環(huán)境性別決定激活劑。

轉(zhuǎn)錄因子Doublesex（Dsx）調(diào)節(jié)通路的差異是動物性別決定機(jī)制進(jìn)化的基礎(chǔ)，但是目前關(guān)于環(huán)境性別決定中Dsx的調(diào)控知之甚少。在D.magna中，環(huán)境性別決定是通過Dsx直系同源基因Dsx1的雄性特異性表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。Mohamad等[59]使用CRISPR/Cas9在水蚤（Daphnia magna）雄性基因組的目標(biāo)位點(diǎn)引入突變，破壞D.magna雄性基因組上Dsx1增強(qiáng)子導(dǎo)致Dsx1表達(dá)的降低。通過CRISPR/Cas9定向誘導(dǎo)，確定Vri為Dsx1的轉(zhuǎn)錄激活因子，表明基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在性別決定中具有顯著的可塑性。

2.1.1.4 研究蛻皮類固醇在水蚤早期胚胎中的作用。

蛻皮類固醇是調(diào)節(jié)節(jié)肢動物生長、繁殖和胚胎發(fā)生的重要激素，但是蛻皮類固醇在水蚤中各個時(shí)期的表達(dá)情況及作用，尤其是早期胚胎中研究尚不明確。Adhitama等[60]用CRISPR/Cas9生成含蛻皮激素響應(yīng)原件（EcRE）和報(bào)告基因（mCherry）的轉(zhuǎn)基因水蚤，命名為EcRE-mCh。EcRE-mCh系統(tǒng)的建立及其在時(shí)空上表現(xiàn)出蛻皮甾體活性的能力，為闡明動物體內(nèi)早期蛻皮甾體作用提供基礎(chǔ)。此外EcRE-mCh還可用于監(jiān)測環(huán)境水中蛻皮類固醇的活性。

2.1.2 脊尾白蝦。

脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）是重要的經(jīng)濟(jì)物種，它的繁殖周期為60 d，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中可以全年保持繁殖能力，因此在基礎(chǔ)研究中比其他蝦種更有優(yōu)勢。它的基因草圖已經(jīng)完成，基因組裝覆蓋了95%以上的編碼區(qū)[61]。近年來CRISPR/Cas9在脊尾白蝦中的應(yīng)用總結(jié)見表1。

2.1.3 夏威夷明鉤蝦。

夏威夷明鉤蝦（Parhyale hawaiensis）廣泛分布于熱帶淺水生境中，近10年中，已經(jīng)成為遺傳和分子細(xì)胞生物學(xué)研究中最有力的甲殼綱動物模型于2014年成功應(yīng)用了CRISPR/Cas9系統(tǒng)[53]。2018年Jarvis等[67]利用合成sgRNA和CRISPR/Cas9敲除夏威夷明鉤蝦的Hox基因，研究Hox基因在附肢鑒定中的相互作用。

2.2 節(jié)肢動物中其他物種的應(yīng)用

2.2.1 果蠅。

果蠅（Drosophila）屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、昆蟲綱（Insecta）、雙翅目（Diptera），是典型的模式生物，廣泛存在于熱帶與溫帶之間。容易飼養(yǎng)、繁殖周期短、性狀豐富等特點(diǎn)讓它成為典型的模式生物，發(fā)育過程經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段。果蠅細(xì)胞系適用于生化試驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、功能基因組學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等研究。目前，針對果蠅細(xì)胞系開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的功能基因組學(xué)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在果蠅中的研究已經(jīng)非常廣泛，表2中列舉了近3年取得的重要進(jìn)展。

2.2.2 蚊科。

昆蟲綱（Insecta）、雙翅目（Diptera）中的蚊科（Culicidae）是多種疾病的傳播載體及阻斷疾病傳播的研究對象，因此在傳染病中對蚊體內(nèi)調(diào)控與病毒共存的相關(guān)基因進(jìn)行基因編輯是目前防控的研究熱點(diǎn)。

在瘧疾的防控研究中，了解按蚊（Anopheles）傳播瘧疾寄生蟲的寄生分子機(jī)制對阻斷疾病傳播非常重要。按蚊的中腸、血淋巴和唾液腺中物質(zhì)與瘧原蟲感染息息相關(guān)，蚊-瘧原蟲相互作用的關(guān)鍵物質(zhì)是阻斷傳播的靶點(diǎn)?？刂漂懺x感染的一個明顯優(yōu)勢是可以通過多種手段進(jìn)行調(diào)控，如激動劑基因缺失，RNAi介導(dǎo)的基因沉默，或通過抗體或小分子干擾。然而，由于缺乏針對按蚊的有效的基因編輯工具，在探索制定瘧疾控制策略方面仍落后于其他方法。最近開發(fā)的基于CRISPR/Cas9的按蚊基因組編輯方法為瘧原蟲宿主因子的研究提供了新的和有前景的工具。瘧原蟲在蚊媒傳播途徑中需要多種激動劑的參與，在轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后干擾相關(guān)激動劑成為控制瘧疾蚊媒傳播的途徑，纖維蛋白原相關(guān)蛋白1（FREP1）是蚊媒傳播途徑中激動劑的一種，Dong等[73]通過CRISPR/Cas9突變FREP1，發(fā)現(xiàn)FREP1突變的成年按蚊，在卵囊和子孢子階段對人和嚙齒類瘧疾寄生蟲的感染均被顯著抑制。但是，F(xiàn)REP1的失活也影響了突變后代多種生命活動過程，包括顯著降低采血傾向、繁殖力和卵孵化率、化膿時(shí)間延遲以及血餐后壽命降低。

伊蚊（Aedes）作為傳播登革熱、寨卡、基孔肯雅熱病毒的媒介也被廣泛關(guān)注，但是缺乏對基因的功能、進(jìn)展進(jìn)行研究的工具。Liu等[74]通過向伊蚊胚胎注射Cas9-sgRNA RNP對犬尿腎上腺素羥化酶（kynurenine hydroxylase，kh）和多巴色素轉(zhuǎn)化酶（dopachrome conversion enzyme）進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)可育伊蚊中有30%～50%產(chǎn)生突變，在子代蛹和成蟲中觀察到眼睛和身體色素沉著缺陷。Ling等[75]使用CRISPR-Cas9基因編輯方法破壞埃及伊蚊Aa5HT2B基因，導(dǎo)致其體型減小、發(fā)育延遲、壽命縮短、卵巢生長受阻、脂質(zhì)積聚顯著減少、胰島素樣肽（ILP）基因ilp2和ilp6的表達(dá)下調(diào)及ilp5和ilp4的表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明，Aa5HT2B與ILP6之間存在調(diào)節(jié)聯(lián)系。這些研究表明，可以用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)作為伊蚊基因組規(guī)模分析和生物學(xué)研究的有效工具來防控多種疾病。

2.2.3 家蠶。

昆蟲綱（Insecta）、鱗翅目（Lepidoptera）中的家蠶（Bombyx mori）作為典型的工業(yè)物種一直為很多地區(qū)提供經(jīng)濟(jì)支持，但是大規(guī)模飼養(yǎng)容易遭受病毒的迫害，通過CRISPR/Cas9技術(shù)對家蠶基因進(jìn)行改造，增強(qiáng)家蠶抗病能力有望成為提高家蠶經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值的新興技術(shù)。

2.2.3.1 靶向敲除病毒。

Dong等[76]在家蠶中構(gòu)建了載體系統(tǒng)（pSL1180-Cas9-U6-sgRNA）包含多重sgRNA和Cas9蛋白，靶向突變家蠶細(xì)胞中的核型多角體病毒（BmNPV）。此外還構(gòu)建了多重編輯載體（PSL1180-Cas9-sgIE1-sgLEF11-sgGP64，sgMultiple）來有效地進(jìn)行基因突變，在病毒入侵后抑制病毒的復(fù)制。這一多重系統(tǒng)可以顯著提高基于CRISPR/Cas9的多重基因組工程在昆蟲病毒研究中的潛力[77]。

2.2.3.2 研究生長發(fā)育基因用于育種。

CRISPR/Cas9也被用于突變生長發(fā)育相關(guān)基因，Xu等[78]使用CRISPR/Cas9突變家蠶中的Hpo基因?qū)е律眢w大小調(diào)節(jié)和發(fā)育出現(xiàn)缺陷、色素積聚、早逝，表明Hpo對于調(diào)節(jié)家蠶的生長和發(fā)育至關(guān)重要。Liu等[79]使用CRISPR/Cas9對家蠶TCTP進(jìn)行突變導(dǎo)致三齡幼蟲發(fā)育停滯并致死，研究發(fā)現(xiàn)生長損傷是由于細(xì)胞減少，并且腸上皮細(xì)胞的增殖和分化也受到影響，家蠶TCTP突變顯著影響碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和消化系統(tǒng)，表明BmTCTP在控制幼蟲的生長和發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

2.2.3.3 防控蟲害。

Xu等[80-82]通過在家蠶中利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)基因突變探索卵特異性蛋白（egg-specific protein，Esp）、卵巢絲氨酸蛋白酶（ovarian serine protease，Osp）和Yorkie的基因功能。卵特異性蛋白是家蠶卵黃蛋白原的一種，研究發(fā)現(xiàn)Esp突變導(dǎo)致雌性不育，突變個體產(chǎn)出卵較小、顏色淺、不能孵化，這種變化可以遺傳給后代;Osp突變也會導(dǎo)致雌性不育，突變體產(chǎn)卵量少于野生型雌性，卵也不會孵化;Yorkie的缺失導(dǎo)致身體尺寸縮小、蛻皮缺陷，并最終導(dǎo)致幼蟲死亡。Esp和Osp對雌性生殖至關(guān)重要，Yorkie是Hippo信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)子，可以作為害蟲管理的潛在靶標(biāo)。

2.2.3.4 研究ITPR在信號網(wǎng)絡(luò)中的作用。

Sun等[83]利用CRISPR/Cas9突變ITPR，ITPR是昆蟲離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽（ITP）的受體，作為多種生理過程的調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)家蠶ITPR突變導(dǎo)致幼蟲期延長了3.5 d，翅膀展平失敗，消化道中食物遷移速度是野生型1.55倍，幼蟲階段排泄量是野生型1.56倍，導(dǎo)致體內(nèi)水分的流失，一氧化氮合酶酶活性和一氧化氮（NO）含量以及下游Ca2+/NO/cGMP信號通路相關(guān)分子顯著上調(diào)，胰島素和蛻皮激素信號通路中的關(guān)鍵基因也受到影響，表明ITPR在調(diào)節(jié)家蠶水的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

2.2.3.5 確定Ovo在家蠶中的作用。

Bi等[84]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變Ovo基因。Ovo是果蠅種系性別確定中重要基因的同源物。研究發(fā)現(xiàn)Ovo突變體的卵形異常，在卵巢中排列無序，性腺發(fā)育異常，翅膀不能正常發(fā)育，Ovo基因在翅原基和表皮中表達(dá)量升高。與野生型動物相比，在Ovo突變體中，涉及Wnt信號通路的基因和翅膀發(fā)育基因WCP10和E74被下調(diào)。這些結(jié)果表明，BmOvo基因在翅變態(tài)中起重要作用。

2.2.3.6 其他應(yīng)用。

Zhang等[85]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)蜘蛛絲蛋白基因成功整合到家蠶基因組中。所得纖維的強(qiáng)度與天然蜘蛛絲一樣強(qiáng)（1.2 GPa抗拉強(qiáng)度），證明了將家蠶作為天然蜘蛛絲生產(chǎn)者用于工業(yè)生產(chǎn)高性能纖維的可行性。此外，Li等[86]證明了CRISPR/Cas9依賴性堿基編輯器（BE3）在家蠶中的使用效率，BE3是一種新的CRISPR工具，無需將DNA雙鏈斷裂即可將胞苷轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（C轉(zhuǎn)化為T），在家蠶中使用BE3作為敲除工具，通過堿基編輯誘導(dǎo)外源和內(nèi)源基因突變的效率高達(dá)66.2%，為節(jié)肢動物中進(jìn)行單堿基和多堿基編輯提供更好的工具。

3 小結(jié)和展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新興的基因工程編輯工具得到了廣泛的關(guān)注，從目前的研究成果可知，在節(jié)肢動物中，模式生物家蠶和果蠅為CRISPR/Cas9的技術(shù)主要研究物種，研究的基因也較為廣泛，技術(shù)多且相對成熟，并且昆蟲綱物種的占比很大，研究類群已經(jīng)擴(kuò)展到5個目10余科。相較于昆蟲綱，甲殼綱類群在CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用相對較少，甲殼綱中包含了克氏原螯蝦、南美白對蝦、中華絨螯蟹、三疣梭子蟹等眾多經(jīng)濟(jì)物種，生長、繁殖、病害防治通路中基因的研究有待深入，由于其與昆蟲綱同屬節(jié)肢動物門，所以昆蟲綱模式生物的應(yīng)用技術(shù)可以為甲殼動物提供參考，例如在伊蚊中的卵黃蛋白原介導(dǎo)法可以為甲殼動物基因編輯目的基因的導(dǎo)入提供參考。在未來的幾年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將作為新興的基因編輯系統(tǒng)在節(jié)肢動物中取得更多的突破和進(jìn)展，為人類進(jìn)一步了解基因、利用基因功能奠定基礎(chǔ)。

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