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    CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展

    2017-06-09 03:02:11李晗張?chǎng)?/span>鮑樹森郝強(qiáng)
    今日健康 2016年11期
    關(guān)鍵詞:基因編輯

    李晗 張?chǎng)巍□U樹森 郝強(qiáng)

    【摘 要】 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的獲得性免疫系統(tǒng),通過其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物crRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相關(guān)蛋(CRISPR-associated,Cas),尤其是Cas9蛋白特異性抑制入侵的DNA。該系統(tǒng)由于其快捷靶向以及其作為一種特定位點(diǎn)核酸酶的高效性和多重修飾的可能性,被廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域。本文主要從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的相關(guān)概念及原理、技術(shù)研究進(jìn)展、應(yīng)用研究進(jìn)以及CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的未來發(fā)展進(jìn)行闡述。

    【關(guān)鍵詞】 CRISPR CRISPR/Cas Cas9 基因編輯

    基因編輯是指對(duì)基因組或表達(dá)產(chǎn)物(RNA)進(jìn)行針對(duì)性修飾的過程。真核生物基因組包含上億萬個(gè)堿基,很難對(duì)其進(jìn)行精確的修飾。但如果能夠簡(jiǎn)單有效地做到,將會(huì)極大地推動(dòng)生物學(xué)基礎(chǔ)理論、醫(yī)藥及生物技術(shù)等方面的研究的進(jìn)展。CRISPR/Cas9作為新一代的基因編輯技術(shù),有著其它技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)。理論上,在基因組中每8bp就有一個(gè)適合 CRISPR/Cas9編輯的位點(diǎn)?;贑RISPR/Cas系統(tǒng)的作用原理,研究人員通過體外人工合成sgRNA(small-guide RNA)與Cas9蛋白的復(fù)合物,成功實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因片段的精確剪切,由此開創(chuàng)了一種通過構(gòu)建RNA序列介導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別并剪輯靶基因的新型基因編輯技術(shù)。由于該技術(shù)的高效性、低成本性和簡(jiǎn)易性,對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究受到各界密切關(guān)注,而且在越來越多的研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。

    1 CRISPR/Cas9技術(shù)的基本原理

    CRISPR/Cas9的基本結(jié)構(gòu)包括tracrRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)序列區(qū)、cas(CRISPR associated system,cas)基因序列區(qū)、CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)序列區(qū),3個(gè)功能區(qū)在

    DNA鏈上呈線性排列。CRISPR序列區(qū)含多個(gè)重復(fù)序列(R區(qū))和間隔序列(S區(qū)),間隔序列被呈半回文結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列隔開。CRISPR序列區(qū)可編碼crRNA(CRISPR RNA),故又被稱為crRNA序列區(qū)。Cas基因區(qū)臨近CRISPR序列區(qū),cas基因種類有很多,其中cas9 基因編碼Cas9核酸酶,該酶受crRNA引導(dǎo),對(duì)DNA靶序列進(jìn)行切割。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為三種類型:TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ,而在化膿鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPE/Cas9系統(tǒng)屬于TypeⅡ型。

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)在噬菌體中起到免疫作用,當(dāng)噬菌體首次入侵宿主時(shí),cas基因編碼的蛋白復(fù)合物會(huì)裂解噬菌體DNA上短間隔序列,并將裂解片段整合入自身DNA的CRISPR序列5端。當(dāng)同種噬菌體再次侵入時(shí),整合了噬菌體DNA片段的CRISPR位點(diǎn)會(huì)轉(zhuǎn)錄出crRNA,在crRNA與一段tracrRNA結(jié)合成為二元復(fù)合體后,與噬菌體DNA 20nt 的長度互補(bǔ)配對(duì),繼而引導(dǎo)Cas9核酸酶切割結(jié)合位點(diǎn)[1]。

    2 CRISPR/Cas9技術(shù)的新發(fā)展

    Samuel等[2]建立了一個(gè)模塊化的存儲(chǔ)單元,利用自我靶向RNA(stgRNA)記錄細(xì)胞內(nèi)分子事件,從而使它能被反復(fù)的改寫來生成新的序列。他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)自我靶向向?qū)NA(stgRNA),它可以不斷地靶向、誘變編碼它的DNA。在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和規(guī)范ATG起始密碼子的下游,他們嵌入了一個(gè)突變檢測(cè)區(qū)(MDR)。這個(gè)可變區(qū)是由stgRNA位點(diǎn)和緊隨它的改良后的u6啟動(dòng)子組成。MDR直接在不同閱讀框的綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)基因后面,GFP和RFP被相應(yīng)的不同閱讀框的“2A自我分裂(切割)多肽”分開。不同的閱讀框架是否與起始密碼子同框,這取決于MDR中插入缺失的大小。不同數(shù)量的堿基刪除會(huì)產(chǎn)生不同的移碼突變,從而表達(dá)不同的熒光蛋白。進(jìn)而記錄細(xì)胞內(nèi)分子事件。

    在基因編輯技術(shù)方面,CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其簡(jiǎn)潔性、高效性已被廣泛用于基因編輯,但同時(shí)也存在著脫靶的現(xiàn)象。Feng Zhang等[3]在構(gòu)成化膿性鏈球菌 Cas9酶的約 1400個(gè)氨基酸中,通過改變 3個(gè)氨基酸將“脫靶編輯”顯著減少至無法檢測(cè)到的水平。該研究小組將這種新設(shè)計(jì)的酶命名為 “增 強(qiáng) 型 ”化 膿 性 鏈 球 菌 Cas9 (SpCas9),可用于需要高水平特異性的基因組編輯應(yīng)用。

    3 CRISPR/Cas9技術(shù)在疾病研究中的應(yīng)用

    3.1 疾病模型的構(gòu)建

    目前,許多遺傳病的研究是通過對(duì)來自患者的iPS細(xì)胞的研究來實(shí)現(xiàn)的,但是這要花費(fèi)幾個(gè)月的時(shí)間,同時(shí)也受到細(xì)胞是否可以得到和遺傳背景多樣性的限制。這一問題可以通過野生型細(xì)胞系的基因編輯來避免。Dominik[4]等利用CRISPR/Cas9引入阿爾茲海默氏癥的任意一種遺傳突變后,發(fā)現(xiàn)在CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)和研究者引入受體細(xì)胞的突變之間存在一段序列上的距離。研究者發(fā)現(xiàn)了特殊的距離關(guān)系,就可以對(duì)干細(xì)胞的基因組進(jìn)行編輯使細(xì)胞包含兩種阿爾茲海默氏癥基因中的任意一種,隨后誘導(dǎo)這些干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為神經(jīng)元細(xì)胞并且產(chǎn)生大量β淀粉樣蛋白,從而模擬阿爾茲海默氏癥的疾病表現(xiàn)。

    3.2 疾病的治療

    目前,病毒治療的策略相對(duì)有限,而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)病毒DNA的清除為病毒的治療提供了新的思路。Kaminski R等[5]證實(shí)利用CRISPR基因編輯系統(tǒng)能夠有效地和安全地將HIV病毒從在體外培養(yǎng)的人T細(xì)胞的DNA中清理掉。我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)院研究所、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、日本京都大學(xué)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院等處的研究人員研究靶向乙肝表面抗原(HBsAg)編碼區(qū)的CRISPR/Cas9系統(tǒng),在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中和活的小鼠體內(nèi)的效果[6]。結(jié)果表明,CRISPR/Cas9可在體內(nèi)和體外抑制HBV復(fù)制和表達(dá),可能是治療HBV感染的一種新策略。

    在遺傳病防治方面,血友病B,是非常適合用于基因治療與基因編輯技術(shù)的疾病。Guan Y等人[7]發(fā)現(xiàn)位于人類F9基因上的突變Y371D能夠引起比Y371S更為嚴(yán)重的血友病。他們用靶向這一基因位點(diǎn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行治療,結(jié)果表明,用腺病毒為載體的基因編輯系統(tǒng)對(duì)小鼠基因糾正率較高,但有較重的肝毒性,需進(jìn)一步改善。Elizabeth等[8]進(jìn)行了人血液紅系祖細(xì)胞的由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯,使得在HBG1和HBG2基因的啟動(dòng)子中的一段13nt的序列發(fā)生了突變,進(jìn)而改變了天然存在的胎兒血紅蛋白(HPFH)相關(guān)突變。而經(jīng)過基因編輯的紅系祖細(xì)胞與胎兒血紅蛋白(HbF)水平的增加也足以抑制鐮狀紅細(xì)胞貧血由于缺氧導(dǎo)致的紅細(xì)胞形態(tài)的改變。這有可能是未來β-地中海貧血基因治療的一項(xiàng)策略。

    CRISPR/Cas9在腫瘤治療方面的研究的主要策略是相關(guān)基因的敲除。2015年,Brandon等[9]首次將CRISPR技術(shù)應(yīng)用到了癌癥相關(guān)的基因治療研究,他們?cè)O(shè)計(jì)了一種慢病毒載體使 CRISPR 系統(tǒng)可以被 doxycycline 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并高效地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行編輯。應(yīng)用這個(gè)系統(tǒng),他們實(shí)現(xiàn)了對(duì) 癌基因MCL-1在體內(nèi)和體外的敲除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,慢病毒 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)高效地實(shí)現(xiàn)了體內(nèi) CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯,通過癌基因的敲除,可以作為一種潛在的新型的癌癥治療方案。CRISPR/Cas9技術(shù)在體外敲除EGFR/EGFRvIII,增加了 UBXN1的表達(dá)同時(shí)減少了NF-κB的表達(dá),最后抑制了成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)的生長。

    4 發(fā)展前景展望

    隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的日益發(fā)展與完善,它在科研的基因編輯領(lǐng)域發(fā)揮重要作用的同時(shí),也將會(huì)給臨床治療提供一個(gè)嶄新的思路,尤其是在抗DNA病毒感染和腫瘤治療方面。隨著靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),也為抗RNA病毒感染提供了新的思路。

    參考文獻(xiàn)

    [1].Jiang, W., et al. Nucleic Acids Res, 2013. 41(20): p. e188.

    [2].Perli, S.D., C.H. Cui, and T.K. Lu. Science, 2016. 353(6304).

    [3].Slaymaker, I.M., et al. Science, 2016. 351(6268): p. 84-8.

    [4].Paquet, D., et al. Nature, 2016. 533(7601): p. 125-9.

    [5].Kaminski, R., et al. Sci Rep, 2016. 6: p. 22555.

    [6].Zhen, S., et al. Gene Ther, 2015. 22(5): p. 404-12.

    [7].Guan, Y., et al. EMBO Mol Med, 2016. 8(5): p. 477-88.

    [8].Traxler, E.A., et al. Nat Med, 2016. 22(9): p. 987-90.

    [9].Aubrey, B.J., et al. Cell Rep, 2015. 10(8): p. 1422-32.

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