洛羅蘭糖苷激活Bcl-2通路誘導(dǎo)髓樣抑制性細(xì)胞凋亡研究

秦 越，龐宗然

（民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中央民族大學(xué)，北京 100081）

洛羅蘭糖苷是從民族藥盤龍參中分離提取的，目前對(duì)于洛羅蘭糖苷的研究還很少。但盤龍參作為民間的一種療效極佳的抗癌中草藥已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。盤龍參為蘭科綬草屬，以根或全草入藥，味甘，性溫，入肺、肝、腎三經(jīng)。《湖南藥物志》記載，盤龍參可“止虛熱口渴，肺瘤咳血”，由于其分布廣泛，還被藏醫(yī)，蒙醫(yī)使用[1]。在藏藥中，盤龍參主要用于強(qiáng)身健體，養(yǎng)氣生精，但是在效能上弱于手參。也有一些民間古方將其作為治療糖尿病的藥物應(yīng)用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，盤龍參對(duì)S180肉瘤，A549肺癌細(xì)胞、BEL7402肝癌細(xì)胞、HT-29食管癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞、SGC-7901胃癌細(xì)胞、K562白血病細(xì)胞和A498腎癌細(xì)胞都有一定毒性，具有明顯的抗腫瘤效果[2-5]，但其具體機(jī)制尚未明確，對(duì)其化學(xué)組分分離，藥理、毒理方面的探索都處于相對(duì)初級(jí)的階段。

髓樣抑制性細(xì)胞（MDSCs）是骨髓細(xì)胞譜系的固有部分，包括某些腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，是樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的前體，主要存在與腫瘤微環(huán)境中，通常被描述為CD14-CD11b+細(xì)胞群，表達(dá)CD33和CD15（在小鼠中被標(biāo)記為Gr1+CD11b+），具有免疫負(fù)調(diào)控的作用。MDSCs可以抑制T細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，參與腫瘤血管生產(chǎn)與癌細(xì)胞遷移等[6]。大量的臨床數(shù)據(jù)顯示，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等癌癥病例中，外周血MDSCs的數(shù)值與癌癥的發(fā)展階段密切相關(guān)[7]。同時(shí)，在癌旁組織中，MDSCs的存在也影響著腫瘤治療的效果，例如，乳腺癌患者的化療反應(yīng)及肝癌的放射治療結(jié)果都與MDSCs的浸潤(rùn)程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[8]。因此，靶向MDSCs可能成為腫瘤治療的一個(gè)有效途徑。

因此，本課題通過(guò)對(duì)洛羅蘭糖苷作用后MDSCs的增殖、凋亡、蛋白表達(dá)幾個(gè)方面的研究，從改善腫瘤微環(huán)境的角度去探求洛羅蘭糖苷的藥用價(jià)值及其抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 MDSCs細(xì)胞系中永生化的細(xì)胞MSC-2（獲贈(zèng)于 Francois Ghirnghelli，腫瘤內(nèi)科）；洛羅蘭糖苷粉末（民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期提?。籇MEM培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器 細(xì)胞計(jì)數(shù)板（中國(guó)博大博聚科技有限公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），GUAVA微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 DMEM+/+培養(yǎng)基的配置 DMEM+/+培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司。取DMEM+/+培養(yǎng)基加入10%的新生牛血清，以及100 U/mL的雙抗（鏈霉素和青霉素）。

1.2.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制 所配制的1×PBS 緩沖液中含有：NaCl 8 g，KCl 0．2 g，Na2HPO4·12H2O 3．63 g，KH2PO40．24 g和 1 000 mL 超純水。

1.2.3 洛羅蘭糖苷母液的制備 取洛羅蘭糖苷粉末加入DMEM+/+培養(yǎng)基，震蕩均勻得到濃度為10 mg/mL的懸液，在細(xì)胞間內(nèi)再0．22 μm濾器過(guò)濾，得到無(wú)菌洛羅蘭糖苷母液。

1.2.4 MSC-2細(xì)胞培養(yǎng) 將水浴鍋調(diào)至37℃，在離心管加入3 mL培養(yǎng)基，在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入10 mL培養(yǎng)基。取出凍存細(xì)胞快速放入水浴鍋中，待細(xì)胞融化后，用紙巾拭去管壁周圍的水份，在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管。離心，1 200 rpm，3 min。棄上清，彈起細(xì)胞，將細(xì)胞均勻接種入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.5 MTT法檢測(cè)洛羅蘭糖苷抑制MSC-2細(xì)胞效果 實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。MSC2細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔。實(shí)驗(yàn)組中加入洛羅蘭糖苷，濃度分別為 0、0．3、0．6和1．2 mg/mL；對(duì)照組加入等體積的DEME+/+培養(yǎng)基。邊孔中加入1×PBS 200 μL以防止邊緣效應(yīng)。放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，每孔避光加入MTT試劑10 μL后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后取出，加入三聯(lián)溶解液（10%SDS，5%異丁醇，0．012 mol/L HCL，蒸餾水溶解）溶解 6 h后，用酶標(biāo)儀（美國(guó) BIO-RAD Laboratories，Philadelphia，PA）測(cè)量570 nm處吸光度。

1.2.6 流式細(xì)胞學(xué)分析 MSC-2細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為5×104/孔，加入洛羅蘭糖苷，終濃度為0．6 mg/mL。陰性對(duì)照每孔加入等體積的DMEM+/+培養(yǎng)基至終體積100 μL/孔。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d。適當(dāng)力度吹打細(xì)胞后吸出液體，分別注入 1．5 mL 離心管，離心（4 000 r/min，4℃）5 min。去上清，加入含2%NCS的PBS 50 μL，依比例加入流式染料，抗體為FITC-AnnexiV和7AAD，冰上放置，抗體染色 30min（7AAD最后染 5 min）后，離心（4 000 r/min，4℃）5 min，沉淀用 200 mL含 2%NCS的PBS重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，上機(jī)檢測(cè)，流式細(xì)胞儀為FACScan flow cytometer（美國(guó) BD Calibur），采用 Flowjo 7．6 進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.7 Western Blotting檢測(cè) MSC-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)洛羅蘭糖苷處理后，用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，置冰中40 min后，先各取1 μL蛋白待測(cè)，再加入4×Loading Buffer，100℃加熱10 min后放入-80℃冷藏。將待測(cè)蛋白稀釋至50 μL，并配置BSA及AB液，60℃放置15 min后用酶標(biāo)儀測(cè)量562 nm處吸光值。測(cè)得數(shù)值代入公式計(jì)算蛋白上樣量。

配置10%和12%凝膠電泳分離膠，放入加好電泳液的電泳儀中，按量向兩膠中加入蛋白，并在兩側(cè)加入5 μL MarkerⅢ，80 V恒壓電泳置溴酚藍(lán)跑出。取出膠體轉(zhuǎn)膜，100 V恒壓電泳70 min后將10%膠轉(zhuǎn)得膜中目標(biāo)蛋白相應(yīng)位置所在條帶剪下。用3%BSA封閉1 h，后分別按比例配置、加入目標(biāo)蛋白的相關(guān)一抗，80 min后洗5×5 min，再加入目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)二抗。60 min后洗5×5 min，取出條帶，加入顯影液后進(jìn)行置于曝光儀中進(jìn)行曝光。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析使用Graphpad prism 5 軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 洛羅蘭糖苷對(duì)MSC-2的毒性作用 將MSC-2細(xì)胞用不同濃度的洛羅蘭糖苷處理24 h。當(dāng)濃度為0．3～1．2 mg/mL 時(shí)，洛羅蘭糖苷對(duì) MSC-2 具有明顯的抑制作用（P＜0．01），且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。RAW為小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞系，MTT結(jié)果顯示，此濃度范圍內(nèi)，洛羅蘭糖苷對(duì)RAW細(xì)胞無(wú)毒性作用。見表1，圖 1。

表1 洛羅蘭糖苷對(duì)MSC-2及RAW細(xì)胞增殖的抑制作用(±s)Tab.1 Inhibitory effect of loroglossin on the proliferation of MSC-2 and RAW cells(x±s)

表1 洛羅蘭糖苷對(duì)MSC-2及RAW細(xì)胞增殖的抑制作用(±s)Tab.1 Inhibitory effect of loroglossin on the proliferation of MSC-2 and RAW cells(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．01；與 0．3 mg/mL 洛羅蘭糖苷組比較，#P＜0．01；與 0．6 mg/mL 洛羅蘭糖苷組比較，△P＜0．01。

組別 增殖抑制率（%）MSC-2 RAW對(duì)照組 81．7±4．1 34．4±2．1 0．3 mg/mL 洛羅蘭糖苷 46．1±1．0* 34．3±0．4 0．6 mg/mL 洛羅蘭糖苷 43．4±6．1* 31．1±3．0 1．2 mg/mL 洛羅蘭糖苷 22．3±1．1*#△ 32．3±1．1

2.2 洛羅蘭糖苷促進(jìn)MSC-2凋亡 MTT結(jié)果顯示，洛羅蘭糖苷作用下，MSC-2細(xì)胞的數(shù)量減少。為進(jìn)一步確定藥物的影響，用不同濃度（0、0．3、0．6、1．2 mg/mL）處理 24 h，然后用 Annexin V-FITC/PI進(jìn)行雙重染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果表明，早期凋亡細(xì)胞百分比由14．7%上升至52．2%。見圖2。統(tǒng)計(jì)分析顯示，洛羅蘭糖苷可促進(jìn)MDSCs的凋亡，且呈劑量依賴性。見表2。

圖1 洛羅蘭糖苷對(duì)MSC-2細(xì)胞活性有抑制作用Fig.1 Loroglossin suppressed proliferation of MSC-2 cells

圖2 洛羅蘭糖苷誘導(dǎo)MSC-2細(xì)胞凋亡Fig.2 Loroglossin induced apoptosis of MSC-2 cells

表2 洛羅蘭糖苷誘導(dǎo)MSC-2細(xì)胞凋亡Tab.2 Loroglossin induced apoptosis of MSC-2 cells

2.3 洛羅蘭糖苷激活Bcl-2信號(hào)通路 為明確洛羅蘭糖苷促進(jìn)MSC-2細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，用洛羅蘭糖苷（0．6mg/ml）刺激 MSC-2 細(xì)胞，于不同時(shí)間段內(nèi)提取蛋白，Western blot結(jié)果顯示，JNK2、細(xì)胞色素C、caspase-9、caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)下降。因此，洛羅蘭糖苷通過(guò)Bcl-2信號(hào)通路誘導(dǎo)MSC-2細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖3 洛羅蘭糖苷對(duì)Bcl-2、cytochrome C、Caspase 9、JNK2及Caspase 3蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of loroglossin on the expression of Bcl-2，Cytochrome C，Caspase 9，JNK2 and Caspase 3 protein

3 討論

在腫瘤微環(huán)境中，髓樣抑制性細(xì)胞的功能主要表現(xiàn)為抑制CD8+T細(xì)胞的活化及殺傷腫瘤細(xì)胞的功能從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。另外，髓樣抑制性細(xì)胞還可通過(guò)下調(diào)穿孔素和IFN-γ的表達(dá)來(lái)抑制自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，抑制樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的分化而下調(diào)抗免疫應(yīng)答[9]。實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用GR1單克隆抗體去除體內(nèi)髓樣抑制性細(xì)胞可以增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出對(duì)多種腫瘤的排斥反應(yīng)[10]。因此，以髓樣抑制性細(xì)胞為靶點(diǎn)的針對(duì)性藥物研發(fā)對(duì)腫瘤免疫治療的發(fā)展具有非常誘人的前景。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究從中草藥盤龍參中分離提取到一種苷類化合物洛羅蘭糖苷。目前，洛羅蘭糖苷的相關(guān)研究文獻(xiàn)很少，因此，本課題中筆者首先對(duì)洛羅蘭糖苷的細(xì)胞毒性進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，洛羅蘭糖苷可以特異性的殺傷髓樣抑制性細(xì)胞。同時(shí)，細(xì)胞凋亡標(biāo)記檢測(cè)顯示，洛羅蘭糖苷對(duì)髓樣抑制性細(xì)胞的殺傷性主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)其凋亡機(jī)制的探究表明，洛羅蘭糖苷可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)JNK2、細(xì)胞色素C、Caspase-9及Caspase-3的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡可分為內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡兩種途徑[11]。外源性凋亡是由膜上受體介導(dǎo)的凋亡，通常這些受體的配體為TNF-α、TRAIL和Fas-L等。內(nèi)源性凋亡是通過(guò)線粒體的凋亡途徑，其受到Bcl-2家族的嚴(yán)格控制。洛羅蘭糖苷處理后，JNK2的表達(dá)上調(diào)抑制了Bcl-2的表達(dá)，從而釋放更多的細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C的大量釋放可以激活下游的Caspase家族，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，洛羅蘭糖苷通過(guò)激活Bcl-2信號(hào)通路誘導(dǎo)髓樣抑制性細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)控，從而具有一定的抗腫瘤作用。