生殖干細(xì)胞的研究進(jìn)展

賈天玉，劉龍會，沈豪飛，張學(xué)紅

生殖干細(xì)胞（germline stem cells，GSCs）[1]又稱卵巢干細(xì)胞（ovarian stem cells）[2]、卵母干細(xì)胞（oocytestem cells）[3]或原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells）[4]。自胚胎形成后，卵泡便進(jìn)入自主發(fā)育和閉鎖的生理過程，該過程不依賴于促性腺激素。胚胎形成6周后原始性腺開始分化，GSCs不斷有絲分裂，細(xì)胞數(shù)增多，體積增大，稱為卵原細(xì)胞（oogonia），約60萬個。胚胎形成8～10周原始性腺才出現(xiàn)卵巢結(jié)構(gòu)。自胚胎形成11～12周，卵原細(xì)胞進(jìn)入第一次減數(shù)分裂，稱為初級卵母細(xì)胞（primary oocyte）。在胚胎形成16～20周時，生殖細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，雙側(cè)卵巢共約600～700萬個生殖細(xì)胞，其中卵原細(xì)胞占1/3，初級卵母細(xì)胞占2/3。從胚胎形成第16周至出生后6個月，單層梭形前顆粒細(xì)胞包繞在初級卵母細(xì)胞周圍形成始基卵泡，這是女性的基本生殖單位，也是卵細(xì)胞儲備的唯一形式。胎兒期的卵泡不斷閉鎖，出生時大約有200萬個，兒童時期大多數(shù)卵泡發(fā)生退化，至青春期只剩下約30萬個。進(jìn)入青春期后，卵泡自主發(fā)育成熟的過程依賴于促性腺激素的刺激，育齡期每月發(fā)育一批卵泡（3～11個），經(jīng)過募集、選擇，其大多數(shù)情況下只有1個優(yōu)勢卵泡可以完全成熟并排卵形成黃體，其余的卵泡發(fā)育到一定程度后閉鎖。在圍絕經(jīng)期，卵巢功能逐漸下降，卵泡數(shù)量明顯減少，易發(fā)生卵泡發(fā)育不全。絕經(jīng)后期卵巢停止分泌雌激素，卵巢功能完全衰竭。女性一生中只有400～500個卵泡最終成熟并排卵，僅占總數(shù)的0.1%左右。一般認(rèn)為卵母細(xì)胞在雌性哺乳動物出生后不會再生。Johnson等[5]在雌性小鼠卵巢內(nèi)發(fā)現(xiàn)GSCs，但現(xiàn)階段GSCs理論體系尚未完善，仍需進(jìn)一步研究。

1 GSCs的提出

GSCs是否存在備受爭議。早在1870年，有學(xué)者基于不同種類哺乳動物（包括人類、貓、狗）的研究發(fā)現(xiàn)，雌性哺乳動物在出生后極短時間內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)量便停止增長[4]。1920年Arai[6]證實(shí)隨著大鼠年齡的增長，卵泡數(shù)目減少，同時提出假設(shè)大鼠青春期前切除一側(cè)卵巢（半絕育），如果卵巢沒有代償機(jī)制，那么切除一側(cè)卵巢的大鼠卵母細(xì)胞數(shù)量應(yīng)該是正常大鼠卵母細(xì)胞數(shù)量的一半，但Arai沒有進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。1923年Allen[7]繼續(xù)Arai的研究，在大鼠青春期前切除一側(cè)卵巢，發(fā)現(xiàn)切除一側(cè)卵巢的大鼠與正常大鼠在組織學(xué)上均存在進(jìn)行有絲分裂的卵巢上皮細(xì)胞，并且在切除一側(cè)卵巢的大鼠中有絲分裂生殖細(xì)胞數(shù)量與生殖周期不同階段密切相關(guān)，暗示細(xì)胞周期性增長的規(guī)律，認(rèn)為進(jìn)行有絲分裂的卵巢上皮細(xì)胞是大鼠出生后卵母細(xì)胞再生的標(biāo)志。然而這些進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞也可能僅是卵泡代償?shù)囊环N表現(xiàn)，即切除一側(cè)卵巢后，另一側(cè)卵巢卵泡中卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞發(fā)生代償性有絲分裂。進(jìn)一步說，即使沒有卵母細(xì)胞再生，這種代償機(jī)制也會發(fā)生。1951年Green等[8]總結(jié)已有研究，認(rèn)為沒有明確證據(jù)表明GSCs的存在，從而說明哺乳動物出生后沒有卵母細(xì)胞再生。1962年P(guān)eters等[9]也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，為了研究小鼠卵泡中DNA的合成，將具有放射性的胸腺嘧啶核苷酸經(jīng)腹腔給予不同妊娠時間小鼠，發(fā)現(xiàn)到胚胎形成第18天時胚胎的DNA合成已經(jīng)變得非常緩慢，即在小鼠胚胎形成的前18天是DNA合成的主要時期，說明出生后小鼠卵巢中的GSCs都是來自胎兒時期。但在此后近半個世紀(jì)中，有關(guān)哺乳動物卵母細(xì)胞再生的研究處于停滯狀態(tài)。

2 GSCs的發(fā)現(xiàn)

2004年，Johnson等[5]研究觀察C57BL/6雌鼠卵泡數(shù)量變化時發(fā)現(xiàn)，在出生后30 d卵泡閉鎖速度開始迅速增高，至出生后42 d未閉鎖卵泡數(shù)量僅為出生時卵泡總數(shù)的1/3（500個左右，包括原始卵泡和發(fā)育早期的初級和次級卵泡），推測出生后卵泡不斷閉鎖，但基于卵泡閉鎖的速度，這一時期已閉鎖卵泡總數(shù)至少有1 200個，多于實(shí)際卵泡閉鎖的數(shù)量，表明存在卵母細(xì)胞再生。因此他們認(rèn)為哺乳動物出生后卵巢中存在GSCs，并且參與卵泡和卵母細(xì)胞的再生。Johnson等[5]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在雌鼠卵巢上皮細(xì)胞層發(fā)現(xiàn)聯(lián)會復(fù)合體蛋白3（synaptonemal complex protein 3，SCP3）、小鼠瓦薩同源物蛋白（mouse vasa homologue protein，MVH） 和 溴 脫 氧 尿 苷（bromodeoxyuridine，BrdU）均為陽性的細(xì)胞。SCP3在減數(shù)分裂細(xì)胞中表達(dá)，通常用于追蹤脊椎動物的性腺分化時間，SCP3免疫反應(yīng)定位于生殖細(xì)胞，包括減數(shù)分裂卵母細(xì)胞、精母細(xì)胞和減數(shù)分裂前精原細(xì)胞[10]。MVH是果蠅VASA蛋白在小鼠體內(nèi)的同源物，特異地表達(dá)于發(fā)育中的生殖細(xì)胞，人類VASA基因也僅在卵巢和睪丸中表達(dá)，表明該細(xì)胞屬于生殖細(xì)胞系[11]。BrdU陽性表明細(xì)胞正在增殖[12]。因此Johnson等[5]認(rèn)為SCP3、MVH和BrdU均為陽性的細(xì)胞極有可能就是生殖干細(xì)胞。2005年Bukovsky等[13]獲取成年女性卵巢表面上皮（ovarian surface epithelium，OSE），在含有雌激素存在的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)后分化為具有卵母細(xì)胞特征的細(xì)胞（直徑為180 μm），并表達(dá)上皮細(xì)胞表面特征性細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK），如CK116、CK5、CK6和CK8等；該細(xì)胞還可發(fā)育至胚泡破裂、排出極體，并表達(dá)減數(shù)分裂中起重要作用的糖蛋白PS1、透明帶蛋白（zonapellucida，ZP），具有次級卵泡的特征。在不含有雌激素的培養(yǎng)基內(nèi)則分化成直徑僅為15 μm的細(xì)胞，如顆粒層細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或表達(dá)波形蛋白的間質(zhì)細(xì)胞。

2008年，Bukovsky等[14]分離了3例卵巢早衰患者的少量卵巢表面組織，在含有雌激素的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天，形成了卵泡樣結(jié)構(gòu)；2例組織在體外受精后出現(xiàn)胚胎樣結(jié)構(gòu)，在形成囊胚樣結(jié)構(gòu)后冷凍保存。該研究表明，卵巢早衰患者卵巢中存在GSCs，經(jīng)體外培養(yǎng)能發(fā)育成為成熟的卵母細(xì)胞，并具備受精能力，為解決卵巢早衰患者的生育問題提供了新思路。

2009年，Zou等[15]用免疫熒光雙標(biāo)記法篩選出MVH和BrdU雙陽性細(xì)胞，將綠色熒光蛋白（green fluorescen tprotein，GFP）基因?qū)脒@些細(xì)胞中，隨后移植到經(jīng)化療后不孕小鼠的卵巢，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生新的卵子和后代，后代中GFP基因的表達(dá)陽性率為26%，進(jìn)一步證實(shí)了GSCs存在的可能。2012年，White等[16]首次應(yīng)用熒光激活細(xì)胞分類法（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）純化成年小鼠和人類卵巢皮質(zhì)組織中稀有的具有有絲分裂活性的細(xì)胞，這些細(xì)胞與原始生殖細(xì)胞基因表達(dá)譜一致，同時進(jìn)行體外培養(yǎng)產(chǎn)生與卵母細(xì)胞形態(tài)及基因表達(dá)一致的細(xì)胞，從而證實(shí)經(jīng)FACS純化的細(xì)胞為GSCs。White等[16]進(jìn)一步將穩(wěn)定表達(dá)GFP的GSCs注入離體人卵巢皮質(zhì)組織，再將該組織植入到小鼠卵巢中后產(chǎn)生了GFP陽性的卵泡，說明GSCs在體內(nèi)和離體時均可產(chǎn)生卵母細(xì)胞。

2015年，Irie等[17]研究認(rèn)為SOX17是GSCs的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。由于不能直接將人類胚胎用于研究，2017年，Kobayashi等[18]使用與人類胚胎發(fā)育過程相似、經(jīng)歷雙胚層過程豬的胚胎進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)GSCs起源于外胚層背側(cè)，此過程的發(fā)生是由于SOX17和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1（B lymphocyte induced maturation protein 1，BLIMP1）上調(diào)導(dǎo)致Wnt和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）表達(dá)，進(jìn)一步完善了SOX17對GSCs作用的理論機(jī)制。同年，Risal等[19]研究小鼠微管相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸類似激酶（microtubule-associated serine/threonine kinaselike，MASTL）對GSCs增殖的作用，在GSCs中特異性沉默MASTL，發(fā)現(xiàn)MASTL沉默并未阻止有絲分裂開始，但導(dǎo)致細(xì)胞無法完成有絲分裂，這表明MASTL在GSCs有絲分裂中必不可少。結(jié)果表明，MASTL通過調(diào)節(jié)磷酸酶活性影響胚胎發(fā)育中GSCs的有絲分裂。2017年，Shin等[20]研究發(fā)現(xiàn)sohlh1和sohlh2基因是卵母細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因素，但不影響其減數(shù)分裂。同年Liu等[21]在雌性小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠出生后1～3 d，GSCs有絲分裂呈活躍狀態(tài)，該研究應(yīng)用磁珠分離GSCs，為應(yīng)用GSCs治療卵巢功能障礙提供希望。

2018年，Mochizuki等[22]研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?（histone deacetylase3，HDAC3）影響GSCs形成。HDAC3缺乏導(dǎo)致體外和體內(nèi)GSCs產(chǎn)生減少。GSCs從胚胎中分化需要BMP4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]，但BMP4在GSCs從胚胎中分化的具體作用機(jī)制尚不明確。2018年Zhang等[24]在前人基礎(chǔ)上對小鼠GSCs進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子OTX2是GSCs形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。體內(nèi)和離體環(huán)境下，下調(diào)OTX2表達(dá)可促進(jìn)胚胎分化為GSCs；當(dāng)體外環(huán)境不存在OTX2時，胚胎分化為GSCs的效率增加且產(chǎn)生的GSCs活力更久；體內(nèi)環(huán)境不存在OTX2時，分化的GSCs數(shù)量更多。以上研究均證明了GSCs的存在，但仍有很多問題亟需解決，比如如何讓卵巢早衰患者卵巢中的GSCs自發(fā)產(chǎn)生新的卵子從而提高受孕可能？如何保證再生卵子質(zhì)量及受精率？這些問題仍有待進(jìn)一步研究。

3 目前GSCs的標(biāo)志

2007年，Liu等[25]在小鼠腦組織和腎臟發(fā)現(xiàn)低水平MVH表達(dá)，這可能說明更多組織表達(dá)MVH，不僅僅是生殖細(xì)胞。2016年Zarate-Garcia等[26]的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。Liu等[25]選取少量人類卵巢皮質(zhì)組織未發(fā)現(xiàn)SCP3的表達(dá)，可能因?yàn)镚SCs不存在于卵巢皮質(zhì)，也可能由于處于靜止期的GSCs不表達(dá)減數(shù)分裂細(xì)胞特異性蛋白。2011年，Parte等[27]研究認(rèn)為c-Kit對生殖細(xì)胞的分化至關(guān)重要，同時也表達(dá)于成體干細(xì)胞，常用于小鼠GSCs的研究。2014年，Zhou等[28]研究發(fā)現(xiàn)GSCs表達(dá)ZP，并且可以區(qū)分GSCs與卵泡膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞，但是ZP僅在卵泡生長時表達(dá)。由于倫理方面等因素，人體卵巢組織的獲得主要是通過卵巢組織活檢，限制了獲取組織的數(shù)量。如果GSCs存在于卵巢髓質(zhì)，獲取的少量卵巢組織根本無法檢測到。此外，大多數(shù)獲得的卵巢組織來源于卵巢相關(guān)疾病患者，已不具備正常卵巢功能。而且卵泡發(fā)育和潛在的卵母細(xì)胞再生可能隨月經(jīng)周期變化，組織活檢并不能觀察到卵巢的周期性變化，即使有少量卵泡再生，經(jīng)統(tǒng)計分析可能最后被認(rèn)為是誤差也不會有統(tǒng)計學(xué)意義。因而對于GSCs的鑒定有待進(jìn)一步研究。

4 GSCs的應(yīng)用

近年Baas[29]將GSCs來源的卵子線粒體移植到體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）患者自身的卵子中，通過改善線粒體供能提高卵子質(zhì)量，從而獲得盡可能高的IVF成功率，同時可避免使用贈卵的線粒體。2015年，Coghlan[30]通過注射GSCs來源的線粒體以提高卵子質(zhì)量，最終獲得IVF活產(chǎn)嬰兒，被稱為第1例干細(xì)胞嬰兒。2017年，Zeng等[31]對雌性小鼠進(jìn)行GSCs移植，有效地恢復(fù)了卵子發(fā)生和內(nèi)分泌功能，然而在移植后第4周，GSCs停止分裂，不再有新卵泡發(fā)生，但這為GSCs進(jìn)一步應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。隨著更多學(xué)者對GSCs研究，其應(yīng)用范圍會更加廣闊。

5 結(jié)語與展望

現(xiàn)階段對小鼠GSCs的研究較多，通過Bukovsky等[14]的研究證實(shí)了GSCs也存在于人出生后的卵巢組織中，但是對人的GSCs研究甚少。主要有兩方面原因，一方面由于人的卵巢組織獲取困難及相關(guān)倫理問題；另一方面由于現(xiàn)有研究分離GSCs的方式主要為磁珠分選和FACS，但因GSCs在卵巢組織中數(shù)量少，所以獲得足夠數(shù)目的GSCs尚有一定難度，提取GSCs技術(shù)有待進(jìn)一步完善。除此之外，GSCs理論機(jī)制有待完善，現(xiàn)有研究不能解釋絕經(jīng)期婦女即使存在GSCs為什么不能產(chǎn)生卵子，卵巢早衰患者如何促使GSCs產(chǎn)生卵子。雖然GSCs的研究尚不成熟，但是其潛在臨床應(yīng)用價值已經(jīng)逐漸被人們意識到[32]。GSCs的研究一旦成熟，便可為卵巢功能不全和卵巢早衰的不孕患者、要求保留生育力的惡性腫瘤患者實(shí)現(xiàn)妊娠[33]。隨著對GSCs的研究不斷深入，新的進(jìn)展必將不斷出現(xiàn)。