丁酸梭菌的培養(yǎng)、鑒定與檢測及其研究進展

◆作者：張吉鹍

◆單位：湖北博大生物股份有限公司，湖北黃石435000

1 丁酸梭菌活菌制劑是重要的腸道保健劑

對營養(yǎng)物質(zhì)進行消化、吸收并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，是動物腸道的重要功能。所以，維持腸道健康，尤其在禁抗之后，就顯得非常必要。目前，市場上有關腸道保健的產(chǎn)品很多，主要以酸化劑、益生菌、中短鏈脂肪酸等為主，而中草藥及其提取物、精油、寡糖、纖維、酶制劑等產(chǎn)品亦發(fā)揮著重要作用。就目前的動物生產(chǎn)實踐看，所有這些方案中微生態(tài)制劑是重要的替抗方案之一。所謂微生態(tài)制劑（Probioties），又叫益生菌制劑（Probiotics）、活菌制劑（Bigone）。它是運用微生態(tài)學原理，利用對宿主有益無害的益生菌，經(jīng)特殊工藝制成的制劑，對動物具有整腸作用，能夠較好地防治動物便秘、炎癥、腹瀉，并對動物的生長具有較好的促進作用。丁酸梭菌制劑既產(chǎn)芽孢又產(chǎn)酸，具有芽孢桿菌制劑與乳酸菌制劑的優(yōu)點，作為活菌制劑穩(wěn)定性較好，不需包被即能耐受胃酸與膽汁酸以及外界（制粒、貯存等）不良條件，是重要的腸道保健劑之一。

2 丁酸梭菌的培養(yǎng)、鑒定與檢測

2.1 丁酸梭菌的培養(yǎng)方法及其應用

大規(guī)模生產(chǎn)下，丁酸梭菌制劑的菌體生物量低，是制約其在動物生產(chǎn)中推廣普及的主要因素。常用的培養(yǎng)丁酸梭菌的方法有固態(tài)培養(yǎng)法、響應面法、混合培養(yǎng)法等。

2.1.1 固態(tài)培養(yǎng)法

謝全喜等（2013）建立的丁酸梭菌固態(tài)培養(yǎng)方法，其關鍵點在于培養(yǎng)基的優(yōu)化與發(fā)酵條件的優(yōu)化：①經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為∶豆粕∶麩皮為1∶1，氯化鈣0.2%；②經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵條件為：72 h、37℃、接種量5%。所生產(chǎn)的丁酸梭菌活菌數(shù)可達2.2×108cfu·g-1。余國蓮等（2013）提出的適合丁酸梭菌制劑大規(guī)模生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)條件為：①培養(yǎng)基起始pH 7.3、溫度37℃、培養(yǎng)時間24 h、接種量3%；②最適培養(yǎng)基組成：葡萄糖10 g、豆粕15 g、玉米粉7 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸銨0.2 g、磷酸氫二鉀 0.5 g、碳酸鈣0.3 g、蒸餾水 1000 mL。

2.1.2 響應面法

響應面法（Response Surface Method），又稱響應曲面法，是通過對響應曲面及等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來擬合響應值與因素之間函數(shù)關系的一種優(yōu)化統(tǒng)計方法，其優(yōu)點是在實驗條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對實驗因素的各個水平進行分析，克服了正交實驗只能對一個個孤立的實驗點進行分析和不能給出直觀圖形的缺陷，所以它被廣泛應用于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化和模型的建立。徐瑩等（2009）利用響應面法優(yōu)化丁酸梭菌清液發(fā)酵工藝，將丁酸梭菌的生物量由6.96×107cfu·mL-1提高到 3×108cfu·mL-1?？浊嗟龋?009）采用中心組合實驗（Central Compose Design，CCD）優(yōu)化丁酸梭菌淀粉培養(yǎng)基，最終將生物量提高到2.55 ×108cfu·mL-1。李雯靜等（2016）對從健康羊糞便中提取到的一株具有良好益生特性和抗逆性能的羊源丁酸梭菌（命名為HDRyYB1菌株）的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，具體內(nèi)容為：①發(fā)酵培養(yǎng)基組分（質(zhì)量體積比）為：面粉3.72%、魚粉0.90%、米粉3.96%、酵母粉 0.60%、NaCl 0.19% 、MgSO4·7H2O 0.19% 、KH2PO40.01%、NaHCO30.01%、CaCO30.48%；②培養(yǎng)參數(shù)為：37℃，初始 pH7.2～7.4，瓶裝量100/250，接種量3%。經(jīng)此優(yōu)化后，HDRyYB1菌株發(fā)酵完全（18h）的芽胞數(shù)可達1.478×108cfu·mL-1，是優(yōu)化前的 2.7 倍。經(jīng)李雯靜等（2016）優(yōu)化用于發(fā)酵的培養(yǎng)基，具有2個顯著特點：一是以米粉、面粉等淀粉質(zhì)原料做碳源，來源廣，價格便宜；二是以魚粉、酵母粉等有機氮做氮源，蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸的含量豐富，不僅為丁酸梭菌的快速生長提供了營養(yǎng)，也為丁酸梭菌后期芽胞的快速產(chǎn)生提供了營養(yǎng)。試驗表明，丁酸梭菌經(jīng)18 h時培養(yǎng)后，芽胞完全成熟，這為進一步用于大規(guī)模生產(chǎn)，提供了數(shù)據(jù)支撐。邢宏觀等（2016）首先采用單因素試驗設計法，即利用Plackett-Burman試驗設計，篩選出影響丁酸梭菌菌體數(shù)的顯著性因素，從而對影響丁酸梭菌生物量發(fā)酵液的相關組分進行初步優(yōu)化；然后在此基礎上，運用最陡爬坡試驗找出中心組合設計的中心點，并確定可降低生產(chǎn)成本的非顯著因素的最低添加量；最后運用響應面分析法進一步優(yōu)化丁酸梭菌的發(fā)酵配方，從而獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成份，并確定最佳培養(yǎng)條件。其試驗結果為：①影響菌體數(shù)量的3個顯著性因素為酵母浸粉、FeSO4與 K2HPO4；②最佳培養(yǎng)基組成為可溶性淀粉2%、酵母浸粉 6%、FeSO41.74%、K2HPO40.37% 、NaCl 0.2% 、Mg-SO40.024%；③菌體數(shù)可達1.01×109cfu·mL-1，較優(yōu)化前的2.3×108cfu·mL-1提高了4.39倍。

2.1.3 與酵母菌混合培養(yǎng)

丁酸梭菌是一種嚴格厭氧菌，培養(yǎng)時對氧極其敏感。生產(chǎn)中常采用往培養(yǎng)基中添加還原性耗氧劑如谷胱甘肽還原鹽或者依靠厭氧生物反應器來達到厭氧的目的。鄧慶等（2013）結合動物生產(chǎn)實際，對丁酸梭菌的培養(yǎng)方法進行了創(chuàng)新，首次采用生物除氧（如將酵母菌與丁酸梭菌混合培養(yǎng)）的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)丁酸梭菌。鄧慶等（2013）比較了添加無機還原除氧劑硫代硫酸鈉、有機還原除氧劑半胱氨酸和丁酸梭菌與酵母菌混合培養(yǎng)3種方法對提高丁酸梭菌的生物量的影響。發(fā)現(xiàn)：①隨著除氧劑添加量的增加，除氧效率不斷提高，當硫代硫酸鈉和半胱氨酸的添加量達到 0.004 g·mL-1時，丁酸梭菌的生物生長量分別達到最 大 值 3.49×108cfu·mL-1與4.24×108cfu·mL-1，當除氧劑的添加量超過 0.004g·mL-1時，反而抑制丁酸梭菌的生長。這是因為除氧劑不能持續(xù)的除氧，到培養(yǎng)末期，除氧劑的除氧效果幾乎為零之故。②以酵母膏胨葡萄糖為（瓊脂）培養(yǎng)基，丁酸梭菌與酵母菌按不同比例接種組成混合菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌與酵母菌之間存在著正的組合效應，當丁酸梭菌與酵母菌的體積比為3∶7，其相應的生物量比為0.517時，組合效應值最大，丁酸梭菌的生物量達到 5.238×107cfu·mL-1，酵母菌生物量為1.68×106cfu·mL-1。

3 丁酸梭菌的鑒定

3.1 菌株富集與分離純化

歐陽志周等（2016）將從不曾使用過任何抗生素及微生態(tài)制劑的仔豬腸道內(nèi)容物中采集的樣品（1g）放入100 mL富集培養(yǎng)基藍蓋瓶中，在80℃熱激10 min，用水冷卻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱富集培養(yǎng)3d，挑選有大量氣泡生成的培養(yǎng)液，進一步在富集培養(yǎng)基中進行富集，傳代5次后，將檢測到有丁酸生成的發(fā)酵液轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。取富集培養(yǎng)的發(fā)酵液在厭氧培養(yǎng)箱里梯度稀釋到10-8，利用滾管技術方法分離單菌落。李永峰等（2005）則是將樣品于37℃靜置富集培養(yǎng)，采用亨蓋特滾管法對乙酸產(chǎn)量高的富集物進行分離純化。

3.2 形態(tài)學觀察

在進行丁酸梭菌的形態(tài)學觀察時，先將鑒定為丁酸梭菌的菌株進行擴大培養(yǎng)，然后在TSN瓊脂平板上觀察其菌落形態(tài)。歐陽志周等（2016）在對分離到的丁酸梭菌（命名為C.butyricum QL-1）進行形態(tài)鑒定時，依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中規(guī)定的方法，利用芽孢染液染色、鏡檢。選取菌形態(tài)和顯微形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進行16S rDNA序列分析鑒定。

3.3 生理生化特征分析

由于丁酸梭菌隸屬梭菌屬，鑒定丁酸梭菌時，可根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊第8版》中鑒定梭菌屬的方法，可采用光學顯微鏡以及掃描電鏡觀察細菌的顯微結構，然后結合生理生化試驗，對菌株鑒定到屬。

3.4 菌株16SrDNA序列分析

李清揚等（2014）采用Hungate厭氧操作技術，從東北地區(qū)土壤中分離到一株產(chǎn)耐低溫淀粉酶菌株C-9，經(jīng)形態(tài)、生理生化、16S rDNA序列分析，鑒定為丁酸梭菌。李圣杰等（2015）對從雞小腸表面黏液中分離到的既產(chǎn)酸又高產(chǎn)淀粉酶的菌株進行生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，確定該分離菌株為丁酸梭菌。遲雪等（2016）對從豬牛糞堆肥、玉米地土壤和腐木混合物的富集樣品中分離到一株降解纖維素的厭氧產(chǎn)丁酸菌，經(jīng)16S rDNA序列分析等鑒定為丁酸梭菌。胡小紅等（2016）從窖泥中分離到一株能利用乳酸產(chǎn)丁酸的菌株BEY8，基于16S rDNA基因序列分析鑒定為梭菌屬。樊曉璐等（2017）采用厭氧培養(yǎng)法從朗姆酒發(fā)酵過程添加的丹多液中分離到9株純菌株，經(jīng)生理生化實驗和16S rDNA序列分析從中鑒定出1株丁酸梭菌Y-1。王騰浩等（2015）采用厭氧培養(yǎng)法進行菌種分離，孔穴瓊脂擴散法進行抑菌活性篩選，并通過形態(tài)學、生理生化特性和16S rDNA基因序列同源性分析進行菌種鑒定，篩選出產(chǎn)高效抑菌蛋白的丁酸梭菌ZJU-F1。歐陽志周等（2016）用梭菌強化培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)從仔豬腸道內(nèi)容物中分離獲得的菌株，將其確定為梭菌屬，再通過16S rRNA同源性分析進一步確定該分離菌株為丁酸梭菌，命名為C.butyricum QL-1。

3.5 將多種方法集成，進行整體鑒定

為準確鑒定丁酸梭菌，目前傾向于將表型（菌落形態(tài)和革蘭染色等）、生化（API 20A和VITEK2等）、16S rRNA序列分析與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜等技術進行集成，進行全面的整體鑒定以獲得最終鑒定結果。鑒定周期長是目前梭狀芽胞桿菌鑒定的主要問題，熒光PCR法在細菌鑒定領域的普及，極大地節(jié)省了鑒定的人力物力，并縮短了試驗周期。董銀蘋等（2018）針對梭狀芽胞桿菌基因序列中屬的特異性與種的特異性基因設計引物和探針，優(yōu)化熒光PCR法反應參數(shù)與反應條件，并用標準菌株、分離株和牛奶樣品對方法的準確性與靈敏度進行驗證。發(fā)現(xiàn)所建立的梭狀芽胞桿菌鑒定用熒光PCR法在屬和種的鑒定上均有較好的準確性和靈敏度，可用于梭狀芽胞桿菌的快速、準確鑒定。

4 丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢數(shù)量的檢測

丁酸梭菌為極其嚴格的厭氧菌，對培養(yǎng)條件要求非?？量蹋貏e是在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，生長效果極差。若采用常規(guī)的滅活營養(yǎng)體再通過涂布平板法計算芽孢數(shù)量不但培養(yǎng)周期長，而且試驗結果誤差大，不具可行性。因此，要準確地測定丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢的數(shù)量是一個極富挑戰(zhàn)性的難題。邢宏觀等（2016）采用測定丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢中特定的物質(zhì)2，6-吡啶二羧酸 （2，6-Pyridine Dicarboxylic Acid，DPA）的含量來間接測定丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢的數(shù)量。DPA為僅存于芽孢中的一種特有物質(zhì)，約占芽孢干重的5%～14%，迄今未在丁酸梭菌營養(yǎng)體細胞中檢測到該物質(zhì)。因此，完全可以通過測定DPA的含量來間接測定芽孢的含量。邢宏觀等（2016）采用高效液相色譜法來測定芽孢中DPA的含量，并參照Fichtel J（2007）一文中所測定的梭菌屬單個芽孢DPA含量標準大概為 2.2×10-16moL） 將最終 DPA濃度換算成芽孢數(shù)。

5 丁酸梭菌抗逆性及其安全性的測定

丁酸梭菌抗逆性檢測包括耐高溫、耐酸與耐膽汁試驗。安全性試驗通常以小鼠作為試驗動物，參照GB15193.3-2003最大耐受劑量法進行。

參考文獻：（略）