體外法評估不同植物精油對需氧菌的抑菌活性

◆作者：張修坤 沈兆艷 呂勇 吳世林

◆單位：廣州智特奇生物科技股份有限公司，廣東廣州510000

隨著人們對抗生素使用造成病原菌產(chǎn)生耐藥性、畜產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)以及動物機(jī)體自身免疫力下降等后果的關(guān)注，并且新出臺的法律法規(guī)也明確規(guī)定了一些禁止在飼料中使用抗生素（毛紅霞等，2011）。尋找有效、無耐藥性、天然無污染、易生產(chǎn)的抗生素替代品已逐漸成為當(dāng)今動物生產(chǎn)加工業(yè)的主要趨勢（楊敏等，2017）。

植物精油（Essential Oil，EO）是植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)，一般以植物的花、葉、枝、根、和果實(shí)等為原料，通過蒸汽蒸餾、壓榨等方式方法萃取出的植物揮發(fā)性芳香物質(zhì)（莊世宏，2002）。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)從香辛料等植物中提取的植物精油具有很好的抗真菌、細(xì)菌及其他微生物的活性（陳屹等，2008）。天然植物精油作為天然飼料防腐劑和胃腸道微生物的調(diào)控劑已成為目前的研發(fā)熱點(diǎn)（朱曉磊等，2013）。

本研究根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)資料以及前期所做工作成果，選擇含有抗菌活性的植物精油，包括肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚，測定其最低抗菌濃度，得到其天然植物精油與硫酸粘桿菌素的效價比，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 精油

市場上出售的不同廠家生產(chǎn)的肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚。

1.2 供試菌種

產(chǎn)腸毒大腸桿菌、出血性大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和乙型溶血性鏈球菌，均購買自廣東省微生物研究所。

1.3 儀器

恒溫恒濕箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-IG型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-924OA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004電子天平（感量0.0001 g）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；培養(yǎng)皿、試管、移液槍、接種環(huán)等。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的配制

將精油加入到5 mL不同菌株所對應(yīng)的培養(yǎng)基中，充分混合，使各精油達(dá)到不同濃度梯度，每組三皿，待培養(yǎng)基凝固后，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌懸液的配制

從經(jīng)過活化的菌體斜面上挑取一環(huán)菌體接種至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用活菌計數(shù)法計數(shù)（管志遠(yuǎn)等，2005）。分別吸取以上培養(yǎng)時間的供試菌液0.5 mL，加入無菌水倍比稀釋到 105～106cfu/mL，備用。

2.3 較強(qiáng)抑菌能力的精油的初選

將產(chǎn)腸毒大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、乙型溶血性鏈球菌接種到不同梯度濃度的固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，放置在38℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18～24h，無菌落長出的最低樣品濃度即為MIC值（王改琴等，2014）。從中選出抑菌能力較強(qiáng)的精油進(jìn)行復(fù)篩。

2.4 較強(qiáng)抑菌能力的精油的復(fù)選

將產(chǎn)腸毒大腸桿菌、出血性大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和乙型溶血性鏈球菌接種到對應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂不均勻，放置在38℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18～24 h，篩選出抑菌能力較強(qiáng)的精油。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 精油初篩試驗(yàn)結(jié)果

精油對需氧有害菌最低抑菌濃度如表1所示。對產(chǎn)腸毒大腸桿菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：肉桂醛（0.02%）=百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）＞山蒼子油（0.12%）；對宋氏志賀氏菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04）=肉桂醛（0.04%）＞牛至油（0.09%）＞丁香酚（0.12%）＞山蒼子油（0.14%）；對乙型溶血性鏈球菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：牛至油（0.06%）＞百里香酚（0.07%）=香芹酚（0.07%）=丁香酚（0.07%）=牛至油（0.06%）＞肉桂醛（0.08%）＞山蒼子油（0.13%）。由試驗(yàn)結(jié)果可知，肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚對本試驗(yàn)所選用供試菌株均有較好的抑制效果，因此選擇該五種精油進(jìn)一步試驗(yàn)。

表1 精油固態(tài)抑菌初篩試驗(yàn)結(jié)果（%）

3.2 精油固態(tài)抑菌復(fù)篩結(jié)果

根據(jù)初步篩選試驗(yàn)結(jié)果選擇了肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚該五種精油進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如上表所示。由試驗(yàn)結(jié)果可知，肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚對本試驗(yàn)所選用供試菌株均有較好的抑制效果。對產(chǎn)腸毒大腸桿菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：肉桂醛（0.02%）=百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）；對出血性腸炎大腸桿菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：肉桂醛（0.02%）＞香芹酚（0.03%）＞百里香酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）；對宋氏志賀氏菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04）=肉桂醛（0.04%）＞牛至油（0.09%）＞丁香酚（0.12%）；對痢疾志賀氏菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：肉桂醛（0.04%）=香芹酚（0.04%）=百里香酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.15%）；對豬霍亂沙門氏菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：百里香酚（0.03%）=香芹酚（0.03%）＞肉桂醛（0.06%）＞牛至油（0.08%）＞丁香酚（0.15%）；對鼠傷寒沙門氏菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：肉桂醛（0.04%）=百里香酚（0.04%）=香芹酚（0.04%）=牛至油（0.04%）＞丁香酚（0.18%）；對乙型溶血性鏈球菌，抑菌能力由強(qiáng)到弱為：牛至油（0.06%）＞百里香酚（0.07%）=香芹酚（0.07%）=丁香酚（0.07%）=牛至油（0.06%）＞肉桂醛（0.08%）。

在5種供試精油中，百里香酚對產(chǎn)腸毒大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、和鼠傷寒沙門氏菌的抑制能力較強(qiáng)，其最低抑菌濃度為0.02%～0.07%。肉桂醛對產(chǎn)腸毒大腸桿菌、出血性大腸桿菌、痢疾志賀氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌能力較強(qiáng)，其最低抑菌濃度為0.02%～0.08%。香芹酚對痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果較好，最低抑菌濃度為0.03%～0.07%。牛至油對鼠傷寒沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌的抑制作用較好，其最低抑菌濃度為0.04%～0.09%。丁香酚抑菌能力弱于其他精油，其最低抑菌濃度為0.07%～0.18%。因此，固態(tài)培養(yǎng)條件下精油對需氧有害菌的抑制作用由強(qiáng)到弱為百里香酚＞肉桂醛＞香芹酚＞牛至油＞丁香酚。

表2 精油固態(tài)抑菌復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果（%）

4 討論

植物精油的抑菌機(jī)理因活性成分的不同而有所差異，但通常認(rèn)為其機(jī)理是精油中活性成分酚類、醇類物質(zhì)進(jìn)攻微生物的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，影響細(xì)胞膜脂質(zhì)層的流動性，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，最終引起細(xì)菌生長受到抑制甚至導(dǎo)致死亡。研究證明，電鏡掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)用肉桂醛、牛至油等精油作用的有害微生物菌妊體形態(tài)出現(xiàn)扭曲、裂解、變扁和變細(xì)的現(xiàn)象，部分精油成分還會影響細(xì)胞膜結(jié)果，抑制相關(guān)酶活，干擾生物活性物質(zhì)和核酸的合成，最終導(dǎo)致有害微生物生長受限甚至造成死亡（BURT等，2003）。此外，香芹酚可使枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜中脂肪酸的比例和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而降低其細(xì)胞膜的流動性。肉桂精油中的有效成分肉桂醛可與膜蛋白反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)的凝結(jié)從而抑制產(chǎn)氣腸桿菌的氨基酸代謝。丁香酚是通過使細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)變性、與細(xì)胞膜上的磷脂發(fā)生反應(yīng)，破壞膜的通透性，干擾蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁的合成，從而抑制微生物的生長。因此推測本試驗(yàn)所篩選的香芹酚、肉桂醛、丁香酚等植物精油通過以上作用方式，破壞大腸桿菌等有害微生物的菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，干擾其生物學(xué)功能的發(fā)揮而產(chǎn)生抑菌、殺菌的效果。

精油的抑菌活性與其成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，一般醛類的抗菌活性最高，其次為酚。此外，醇類、醚類和烴類物質(zhì)也具定的抑菌活性。而本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)不同精油對腸道有害菌的抑制作用由強(qiáng)到弱為百里香酚＞肉桂醛＞香芹酚＞牛至油＞丁香酚，與理論有差異，可能是由于精油的水溶性對抑菌效果影響所導(dǎo)致。

5 結(jié)論

綜上所述，固態(tài)培養(yǎng)條件下，肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚對產(chǎn)腸毒大腸桿菌、出血性大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和乙型溶血性鏈球菌均有較好的抑菌效果，抑制作用由強(qiáng)到弱為百里香酚＞肉桂醛＞香芹酚＞牛至油＞丁香酚。肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油用于飼料中可以較好地殺滅有害菌，調(diào)整腸道微生物區(qū)系。

參考文獻(xiàn)：（略）