miR-19b 通過激活A(yù)kt 信號通路保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡

朱宏文, 喻溥蛟, 許嘉鴻

(1. 上海市安亭醫(yī)院心血管內(nèi)科, 201805; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科, 上海200065)

缺血性心臟病是常見的心血管疾病之一, 其致死率和致殘率較高, 嚴(yán)重危害人類健康. 目前已知的治療缺血性心臟病最有效的方法是及時有效地恢復(fù)心臟血流, 即再灌注治療[1]. 然而, 再灌注的治療過程會對已經(jīng)發(fā)生缺血的心肌細(xì)胞造成進(jìn)一步損害, 包括心肌細(xì)胞功能異常和細(xì)胞死亡, 這種心肌短時間內(nèi)血流供應(yīng)中斷, 在一定時間恢復(fù)血流后, 原本已經(jīng)缺血的心肌會發(fā)生更為嚴(yán)重的損傷, 稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[2]. MIRI 的機(jī)制目前尚不清楚, 通常認(rèn)為與炎癥、鈣超載、氧自由基的釋放等有關(guān)[3-6].目前, 依然缺乏有效的減輕MIRI 的方法[7], 因此尋找防治MIRI 的有效措施具有十分重要的意義.

微小RNA(microRNAs 或miRNAs)是高度保守的非編碼基因序列, 通常有21～23 個堿基參與轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控, 多項研究表明miRNAs 在MIRI 發(fā)生發(fā)展過程中起到十分關(guān)鍵的調(diào)控作用[8-10]. miR-19b 是miR-17-92 基因簇的關(guān)鍵成員之一, 在腫瘤研究中miR-17-92 基因簇具有重要的抗凋亡作用[11]. 另外有研究報道, miR-19b 在心肌細(xì)胞中高表達(dá)并且為調(diào)控心肌增殖的重要分子[12], 這提示miR-19b 可能在心臟生理病理過程中發(fā)揮重要作用, 但是目前miR-19b 在心肌缺血再灌注損傷中的作用尚不清楚. 本工作探討miR-19b 在新生大鼠心肌細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)模型中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制.

1 實驗材料和方法

1.1 提取新生大鼠心肌細(xì)胞

用消化酶分解法提取新生大鼠心肌細(xì)胞, 75%酒精消毒后, 眼科剪摘取乳鼠心臟, 去除大血管及心房后在超凈臺中剪碎; 加入消化液在37?C 搖床上震蕩消化, 每隔30 min 換一次消化液, 直至組織塊完全消失; 每次收集上清以馬血清終止消化, 離心后去上清, 以重懸細(xì)胞團(tuán)塊, 用孔徑為100 μm 的一次性篩網(wǎng)過濾掉膠原纖維等; 用“8”字法搖培養(yǎng)皿, 然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱差速貼壁30～60 min, 將差速貼壁后的細(xì)胞懸液(未貼壁細(xì)胞)吸取到50 mL 離心管中,1 000 r/min, 離心5 min, 棄上清; 用溫育的1×ADS(adenosine 5’-triphosphate disodium salt)重懸細(xì)胞, 運(yùn)用Percoll 法獲得高純度的心肌細(xì)胞, 用原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM(dulbecco’s modified eagle edium)+5%胎牛血清+10%馬血清+1%雙抗)重懸細(xì)胞, 并按實驗計劃所需的細(xì)胞密度布板, 細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理.

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理, 用無血清培養(yǎng)基稀釋miR-19b 模擬物(mimics)(終濃度50 nmol/L)、miR-19b 抑制物(inhibitor)(終濃度100 nmol/L)以及同源磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)-siRNA(終濃度75 nmol/L), Lipofectamine-2000助轉(zhuǎn)染, 轉(zhuǎn)染6～8 h 后換液(無血清培養(yǎng)基).

1.3 OGD/R 模型建立

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理步驟結(jié)束20 h 時, 將細(xì)胞用無糖培養(yǎng)基(Gibco, 11966-025 公司)換液, 細(xì)胞板放入缺氧盒, 并在缺氧盒中同時放入缺氧袋(三菱電機(jī)(廣州)壓縮機(jī)有限公司), 培養(yǎng)箱孵育8 h 后, 換成原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)基, 復(fù)氧復(fù)糖12 h.

1.4 α-actinin 與TUNEL 共染

在實驗終點(diǎn)從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)板, 棄掉培養(yǎng)基, 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 4%的多聚甲醛固定細(xì)胞, 室溫, 20 min; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 0.2% 的Trition X-100 破膜, 室溫, 20 min; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS,10%山羊血清封閉, 室溫, 1 h; 吸盡封閉液,用10%山羊血清稀釋一抗, 孵一抗(α-actinin), 4?C, 過夜孵育; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 10%山羊血清配制熒光二抗(cy3-anti-mouse),室溫,搖床孵育2 h(從此步驟開始全程避光);PBS 洗3 次,每次5 min;按照試劑盒(Vozyme, A111)說明書染TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’-deoxyuridine 5’-triphosphate-biotin nick end labeling), 結(jié)束后PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 用PBS 配制Hoechst, 染核, 室溫, 20 min; 到熒光顯微鏡下觀察和拍攝.

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法

在實驗終點(diǎn)將細(xì)胞板中的培養(yǎng)基吸盡, PBS 洗1 次, 吸盡PBS, 加入適量裂解液, 用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下來, 吸取至EP(eppendorf) 管, 冰上裂解細(xì)胞40 min 后, 4?C,14 000 g 離心20 min, 取上清液, 酶標(biāo)儀測定蛋白樣品的濃度后, 定容定量, 保證每次上樣量一致. 加入5× 蛋白上樣緩沖液, 震蕩混勻, 100?C 水浴或者金屬浴熱變性5～10 min.配置十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacry lamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠, 等蛋白樣品冷卻到室溫后, 將其直接上樣到SDS-PAGE 加樣孔內(nèi). 100 V 恒壓電泳90 min, 結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜,用含5%脫脂奶粉的TBST(tris-buffered saline and tween)緩沖液封閉2 h, 一抗孵育, 4?C孵育過夜. TBST 洗3 次, 每次10 min. 加入二抗, 搖床上室溫孵育2 h, TBST 洗3 次, 每次10 min. 最后迅速以ECL(enhanced chemiluminescent)發(fā)光液于膜上反應(yīng)約1 min, 化學(xué)發(fā)光儀掃描并分析圖片.

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析, 數(shù)據(jù)均采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示, 組間比較采用單因素方差分析(one way analysis of variance), 兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗分析方法. P <0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性.

2 實驗結(jié)果

2.1 miR-19b 對OGD/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用

圖1 TUNEL 法檢測OGD/R 模型中轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 和miR-19b inhibitor 后的新生大鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat cardiac myocytes, NRCM)凋亡水平Fig.1 Apoptosis of NRCM transfected by miR-19b mimics and miR-19b inhibitor in the OGD/R model as determined by TUNEL assay

圖2 新生大鼠心肌細(xì)胞OGD/R 模型中轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 后凋亡蛋白表達(dá)水平Fig.2 Apoptosis protein expression of NRCM transfected by miR-19b mimics in the OGD/R model

圖3 新生大鼠心肌細(xì)胞OGD/R 模型中轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor 后凋亡蛋白表達(dá)水平Fig.3 Apoptosis protein expression of NRCM transfected by miR-19b inhibitor in the OGD/R model

本工作利用TUNEL 法和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測心肌細(xì)胞氧糖剝離再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平(見圖1～3).TUNEL 染色結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 可緩解OGD/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡, 而miR-19b inhibitor 可進(jìn)一步加重OGD/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡(見圖1). 圖1 中, Nc 表示空白對照,*表示P < 0.05, n=4. 同時, 蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果表明, 在OGD/R 模型中, 轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 可使Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率均降低(見圖2), 而轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor 能夠上調(diào)Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率(見圖3). 這里, 圖2 顯示了在OGD/R 模型中轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 的蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果, 其中*表示P <0.05, **表示P <0.01; n=3. 而圖3 顯示了在OGD/R 模型中轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor的蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果, 其中*表示P <0.05, ***表示P <0.001; n=3.

2.2 miR-19b 可通過負(fù)向調(diào)控PTEN 激活A(yù)kt 信號通路

本工作利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測新生大鼠心肌細(xì)胞中PTEN、308 位點(diǎn)磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt)表達(dá)水平. 結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 后, PTEN 表達(dá)水平降低, pAkt308/tAkt 比率升高(見圖4), 而轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor 后, PTEN 表達(dá)水平升高,pAkt308/tAkt 比率降低(見圖5). 這里,圖4 顯示了轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 后的PTEN、308位點(diǎn)磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt)蛋白表達(dá)水平結(jié)果, 其中*表示P < 0.05, n = 3. 圖5 顯示了轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor 后的PTEN、308 位點(diǎn)磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt)蛋白表達(dá)水平結(jié)果, 其中*表示P <0.05, **表示P <0.01; n=3.

圖4 NRCM 轉(zhuǎn)染miR-19b mimics 后的PTEN、308 位點(diǎn)磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt) 蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression of PTEN, Phospho-Akt(Thr308) and total Akt in NRCM transfected by miR-19b mimics

圖5 NRCM 轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor 后的PTEN、308 位點(diǎn)磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt) 蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression of PTEN,Phospho-Akt(Thr308)and total Akt in NRCM transfected by miR-19b inhibitor

2.3 PTEN 是miR-19b 對OGD/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵分子

利用TUNEL 法檢測OGD/R 誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平. TUNEL 染色結(jié)果顯示, PTEN-siRNA 可以降低OGD/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡水平, 且PTEN-siRNA 可逆轉(zhuǎn)miR-19b inhibitor 對心肌細(xì)胞凋亡水平的促進(jìn)作用(見圖6, 圖中**表示P < 0.01, n = 4). 本工作設(shè)計了2 條PTEN 的siRNA(PTEN-siRNA4 和PTEN-siRNA5).

圖6 TUNEL 法檢測NRCM 轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor 和/或PTEN-siRNA 后的凋亡水平Fig.6 Apoptosis of NRCM transfected by miR-19b inhibitor and/or PTEN-siRNA as determined by TUNEL assay

3 討 論

miR-17-92 是目前被研究得最多的miRNA 基因簇, 而miR-19b 是該基因簇的關(guān)鍵成員之一. 除了在乳腺癌和肝細(xì)胞癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促增殖和抗凋亡作用外[13-14],miR-19b 在心血管疾病的調(diào)控中也起重要作用, 包括動脈粥樣硬化、心臟纖維化、心肌肥厚等[15-17].

本工作構(gòu)建了新生大鼠心肌細(xì)胞氧糖剝離再灌注(OGD/R)模型, 模擬心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的過程; 利用miR-19b mimics 和miR-19b inhibitor 來過表達(dá)和抑制miR-19b 的表達(dá); 運(yùn)用TUNEL 法和蛋白質(zhì)免疫印跡法來檢測心肌細(xì)胞凋亡水平. 結(jié)果表明, miR-19b mimics 可降低OGD/R 模型誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡, 而miR-19b inhibitor 作用則相反. 凋亡蛋白表達(dá)水平(Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率)檢測結(jié)果也與TUNEL 染色結(jié)果一致, 那么miR-19b對心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用是通過哪個下游靶點(diǎn)實現(xiàn)的呢？已有研究發(fā)現(xiàn), PTEN 是miR-19b 的下游靶基因之一, PTEN 可通過將PI3K 去磷酸化, 來抑制Akt 信號通路, 而PI3K-Akt 通路是MIRI 的經(jīng)典調(diào)控通路之一[18-20]. 本工作通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測PTEN 和Akt 磷酸化, 明確了miR-19b 可下調(diào)PTEN 的作用, 從而激活A(yù)kt 信號通路.另外, 功能逆轉(zhuǎn)實驗也證實了PTEN 的確是miR-19b 保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵下游分子, 因此本工作的結(jié)論是, miR-19b 可通過下調(diào)PTEN、激活A(yù)kt 信號通路, 從而保護(hù)OGD/R 模型誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡.

另外, 本工作還存在很多不足之處: ①尚有待進(jìn)一步進(jìn)行動物整體水平的功能研究; ②分子間相互作用機(jī)制的研究較為淺顯. 在后續(xù)研究中, 將進(jìn)一步完善動物實驗, 并將進(jìn)一步深入探究分子間相互作用的機(jī)制.

總之, 本工作揭示了miR-19b 在OGD/R 模型誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用及其分子機(jī)制, 為后續(xù)的體內(nèi)實驗提供一定的研究基礎(chǔ), 也為將來心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的潛在干預(yù)靶點(diǎn).