梯度有序支架材料誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的定向遷移

李夢(mèng)媛, 李曉然, 戴建武, 文鐵橋

(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海200444;2. 中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所納米-生物界面研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇蘇州215123;3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川750004)

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷, 脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元大量缺失, 星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成新的微環(huán)境, 分泌出基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal-cell-derived factor-1α, SDF1α)形成濃度梯度, 可長(zhǎng)距離募集神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs) 遷移到損傷部位[1]. 然而, SDF1α 在損傷部位濃度低且保留時(shí)間短, 導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞不能形成足夠的群落實(shí)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接, 這是脊髓損傷修復(fù)效果不佳的原因之一[2]. 近年來(lái), 已有學(xué)者通過(guò)注射、移植包載SDF1α 的活性材料到骨損傷[3]、心肌損傷[4]、軟骨損傷[5]等的損傷部位, 實(shí)現(xiàn)SDF1α 局部梯度濃度釋放, 可誘導(dǎo)自體干細(xì)胞遷移到損傷部位, 促進(jìn)組織再生. 本工作采用靜電紡絲法制備放射狀膠原/聚己內(nèi)酯(polycaprolactone, PCL)電紡纖維支架, 擔(dān)載具有膠原特異結(jié)合區(qū)的SDF1α, 制備得到膠原特異結(jié)合的SDF1α(collagen-binding domain SDF1α, CBD-SDF1α)梯度有序支架, 在進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)后, 研究出此梯度有序支架材料對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞球遷移能力的影響.

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

PCL (Sigma); 1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟-2-異丙醇(Sigma); 胰酶替代物(Gibco); 表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)(Peprotech); 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Peprotech); B27(Gibco)等.

1.2 儀器

激光共聚焦掃描顯微鏡(A1RSi, 尼康); 場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(Quanta 400 FEG,美國(guó)FEI); CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERA cell i150, 賽默飛); 微量注射泵(KDS100, 美國(guó)KDS)等.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 梯度有序纖維支架的制備

纖維支架溶質(zhì)為膠原與PCL, 以3∶7 比例混合溶于六氟異丙醇(濃度比為20%). 固定靜電紡絲裝置, 接收裝置采用點(diǎn)電極與環(huán)形電極的組合[6]. 使用微量注射泵泵出膠原和PCL 的混合溶液, 控制其流速為0.15 mL·h?1, 控制高壓直流電源電壓為10 kV; 溶液噴頭距接收裝置的距離約為10 cm.

2.2 CBD-SDF1α 的制備

制備負(fù)載CBD-SDF1α, 大腸桿菌BL12(DE3)負(fù)載pET-CBD-SDF1α 質(zhì)粒以表達(dá)CBDSDF1α 蛋白, 并用6×HIS 純化標(biāo)簽純化和檢測(cè)[3].

2.3 支架材料孵育CBD-SDF1α

將膠原/PCL 纖維支架材料用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide; 1-hydroxypyrrolidine-2, 5-dione, NHS) 交聯(lián)后, 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS) 清洗3 遍. 支架材料在75% 的乙醇中浸泡2 h 消毒, PBS 清洗3 遍. 將500 μL 的CBD-SDF1α(0.5×10?6M)滴加在交聯(lián)后的支架材料上, 在37?C 培養(yǎng)箱中孵育2 h.

2.4 NSCs的分離培養(yǎng)

出生24 h 的美國(guó)癌癥研究所(Institute of Cancer Research, ICR)飼養(yǎng)小鼠斷頸處死后放入75%的乙醇中浸泡消毒, 在超凈工作臺(tái)中提取其大腦海馬區(qū). 使用胰酶替代物在37?C 恒溫下消化分離的海馬區(qū)10 min, 然后將獲得的細(xì)胞重懸培養(yǎng)在無(wú)血清的DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)/F12培養(yǎng)基中,同時(shí)添加20 ng·mL?1bFGF、20 ng·mL?1EGF、B27、丙酮酸鹽和非必需氨基酸[7]進(jìn)行NSCs 培養(yǎng).

2.5 NSCs 的遷移

將NSCs 接種在材料外周, 使用貼壁培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h (貼壁培養(yǎng)基：高糖DMEM/F12、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 和B27) 后, 更換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d (分化培養(yǎng)基:DMEM/F12 和B27). 在培養(yǎng)1 d 后, 用4% 多聚甲醛固定NSCs 20 min, 然后再用0.08%triton X-100 透膜5 min, 用5% 牛血清白蛋白(albumin from bovine serum, BSA) 封閉30 min. 將處理后的NSCs 樣品4?C 恒溫下孵育一抗12 h. 最后, 在室溫孵育二抗和4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)40 min 后, 使用激光共聚焦掃描熒光顯微鏡觀察拍照.

2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理和計(jì)算采用Microsoft Office Excel 2007 軟件, 數(shù)據(jù)以“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)”的形式表示, 各指標(biāo)組間差異采用t 檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 梯度有序纖維支架

圖1 為CBD-SDF1α 梯度支架材料圖. 如圖1(b)中的梯度有序纖維支架掃描電子顯微鏡圖(scanning electron microscope, SEM)所示, 利用靜電紡絲技術(shù)制備一種可同時(shí)提供有序纖維結(jié)構(gòu)和梯度濃度生物信號(hào)分子的新型梯度材料. 該材料中心密度高, 外周密度低, 由此形成外周向中心逐漸增大的連續(xù)性密度梯度, 這種有序纖維結(jié)構(gòu)可促進(jìn)NSCs 遷移的接觸引導(dǎo). CBD-SDF1α 孵育在制備好的支架材料上, 形成穩(wěn)定結(jié)合的CBD-SDF1α 濃度梯度.CBD-SDF1α 是具有膠原特異結(jié)合性的基質(zhì)衍生因子[8], 選用制備的材料中含有30%的膠原成分, 此支架材料可以與CBD-SDF1α 特異結(jié)合, 增大結(jié)合穩(wěn)定性并且使CBD-SDF1α 存留時(shí)間更長(zhǎng), 可使其緩慢釋放[9]. 趨化因子受體4(chemokine receptor-4, CXCR4)是CBD-SDF1α的特異受體, 其強(qiáng)烈的趨化作用可促使NSCs 以及NSCS 遷移運(yùn)動(dòng), 這將有利于NSCs 從CBD-SDF1α 低濃度區(qū)域向高濃度區(qū)域遷移.

圖1 CBD-SDF1α 梯度支架材料Fig.1 CBD-SDF1α embedded in the radially aligned electrospun fiber scaffolds

3.2 NSCs在梯度有序支架上的遷移

圖2 為有序梯度支架材料上NSCs 和NSCS 的遷移圖. 圖2(a)中, 將NSCs 種植在支架材料外周(紅色虛線右側(cè))[10], 在貼壁培養(yǎng)2 h 后, 更換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d, 激光共聚焦掃描熒光顯微鏡拍照發(fā)現(xiàn)NSCs 沿著CBD-SDF1α 濃度梯度由低(材料外周)向高(材料中心)方向定向遷移. DAPI 染色觀察到部分NSCs 遷移至材料中心區(qū)域[11].

將體外增殖培養(yǎng)4 d 的NSCS 如上所述種植在支架材料外周, 在貼壁培養(yǎng)2 h 后, 更換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d 后觀察如圖2(b)中的DAPI 染色所示, NSCS 在遷移過(guò)程中由團(tuán)聚狀態(tài)分散成單個(gè)細(xì)胞繼而沿支架梯度由CBD-SDF1α 低濃度區(qū)域向高濃度區(qū)域遷移, 部分遷移出來(lái)的單細(xì)胞遷移至材料中心區(qū)域.

圖2 有序梯度支架材料上NSCs 和NSCS 的遷移Fig.2 Migration of NSCs and NSCS on orderly gradient fiber scaffolds

圖3 為NSCS 在有序梯度支架上的遷移圖. 圖中(b)～(e)為NSCS 種植在放射狀有序支架外周后遷移1 d 的局部放大圖, 其中(b)為支架材料中心的部位即支架材料CBD-SDF1α 最高濃度區(qū)域, 可觀察到有少量NSCs 遷移到此處. NSCS 擴(kuò)散出的NSCs 沿著CBD-SDF1α 濃度低的外周遷移至濃度高的中心(約5 mm).

圖3 NSCS 在有序梯度支架上的遷移Fig.3 Migration of NSCS on aligned gradient fiber scaffolds

圖4 顯示了NSCS 的擴(kuò)散情況. 圖中(a)為種植在梯度有序支架材料外周的NSCS 在不同區(qū)域擴(kuò)散出NSCs 數(shù)目的對(duì)比圖. 由于支架材料由中心至外周密度梯度逐漸降低, 故支架上負(fù)載的CBD-SDF1α 濃度也逐漸降低. 種植在距支架材料中心6 mm 位置處的NSCS 擴(kuò)散出的NSCs 數(shù)目較種植在距支架材料中心8 mm 位置處擴(kuò)散出的顯著增大(p<0.01). (b)為種植的NSCS 在支架材料不同位置擴(kuò)散出NSCs 的面積與NSCS 面積比的對(duì)比圖. 種植在距離材料中心6 mm 位置處的NSCS 擴(kuò)散出的NSCs 面積與NSCS 總面積之比, 與種植在距離材料中心8 mm 位置處的NSCS 擴(kuò)散出的NSCs 面積與NSCS 總面積比相較顯著增大(p <0.05),說(shuō)明CBD-SDF1α 濃度越高NSCS 擴(kuò)散出的NSCs 越多, 并且擴(kuò)散的距離更遠(yuǎn), 形成的擴(kuò)散面積更大.

圖4 NSCS 的擴(kuò)散情況Fig.4 Diffusion of NSCS on aligned gradient fiber scaffolds

圖5 為NSCS 在有序梯度支架材料上的定向遷移圖. 分別選取(a)和(b) 2 個(gè)不同方向進(jìn)行拍攝, 可明顯觀察到NSCS 有沿纖維支架方向遷移的趨勢(shì), 且有部分NSCs 從NSCS 中遷移出.

圖5 NSCS 在有序梯度支架材料上的定向遷移Fig.5 Directional migration of NSCS on aligned gradient fiber scaffolds

3.3 NSCS的遷移形態(tài)

圖6 為NSCS 遷移過(guò)程中的形態(tài)圖. 圖中, NSCS 遷移培養(yǎng)1 d 后熒光染色, DAPI (藍(lán)色)、Nestin(綠色)、CXCR4(紅色)標(biāo)志NSCS 遷移過(guò)程中的形態(tài)變化. CXCR4 是基質(zhì)衍生因子SDF1α 的特異性受體, 在NSCs 遷移過(guò)程中起重要的調(diào)控作用[12-14]. 圖6(c)顯示了NSCS在纖維方向上(橫向)呈明顯伸展形態(tài), 表明NSCS 中的CXCR4 積極應(yīng)答CBD-SDF1α, 使NSCS 沿著梯度有序纖維方向上呈現(xiàn)極化及定向延伸.

4 結(jié)束語(yǔ)

本工作通過(guò)簡(jiǎn)單易行、條件可控的方法制備連續(xù)性密度梯度有序纖維支架, 負(fù)載CBDSDF1α 形成連續(xù)性濃度梯度有序支架. 這種納米至微米級(jí)的梯度材料同時(shí)提供有序拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與生物活性分子濃度梯度, 可誘導(dǎo)NSCs 以及NSCS 長(zhǎng)距離定向遷移. 在此過(guò)程中還可以觀察到, NSCS 在遷移中會(huì)緩慢遷移出NSCs, 在CBD-SDF1α 濃度高的纖維支架區(qū)域遷移出的NSCs 在遷移數(shù)量與距離上明顯高于在CBD-SDF1α 濃度低的纖維支架區(qū)域. 本實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)用于修復(fù)脊髓損傷時(shí)誘導(dǎo)NSCs 由脊髓斷端向中心缺損部位定向遷移的情況有待進(jìn)一步探究.

圖6 NSCS 遷移過(guò)程中的形態(tài)Fig.6 Cell morphology of NSCS migrated on the aligned fiber scaffolds