黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵液的抗菌活性及其穩(wěn)定性研究

楊勇 章帥文 張勇 劉群 李昆太

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

我國是人口眾多的農(nóng)業(yè)大國，也是農(nóng)藥和化肥污染極為嚴(yán)重的國家?；瘜W(xué)農(nóng)藥的濫用不僅會(huì)對(duì)人類生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生惡劣的影響，還會(huì)導(dǎo)致病蟲害抗性等問題。生物農(nóng)藥因其低殘留、低毒、不易產(chǎn)生抗藥性、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為世界各國的研究重點(diǎn)。開發(fā)新型生物農(nóng)藥，減少和替代高毒高殘化學(xué)農(nóng)藥成為發(fā)展綠色安全農(nóng)產(chǎn)品的必要條件［1］。農(nóng)用抗生素主要是指生物農(nóng)藥中的微生物源農(nóng)藥，目前在殺蟲和殺菌方面已取得顯著的防治效果，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)［2］。放線菌因具有復(fù)雜的次級(jí)代謝系統(tǒng)，能產(chǎn)生諸多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，成為重要的微生物農(nóng)藥資源而倍受關(guān)注。

經(jīng)過多年的研究探索，我國對(duì)于抗生素的篩選和發(fā)酵工藝等已有了很大程度的改善和提高，先后研發(fā)了很多實(shí)用價(jià)值極高的殺菌農(nóng)用抗生素和抗病毒農(nóng)用抗生素［3］，并成功地商業(yè)化應(yīng)用于生產(chǎn)當(dāng)中。例如，被用來殺蟲的有阿維菌素、多殺菌素和南昌霉素；被用來殺菌的有放線菌酮、春雷霉素、萬隆霉素、多效霉素、井岡霉素、農(nóng)抗120、多抗霉素、中生菌素及寧南霉素等；被用來除草的有雙丙氨膦等［4-7］。因此，從放線菌及其次生代謝產(chǎn)物中篩選廣譜、穩(wěn)定及低毒的農(nóng)用抗生素具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)室長期致力于農(nóng)用抗生素的基礎(chǔ)研究，先后開發(fā)出多種具有殺蟲和強(qiáng)殺菌功效的農(nóng)用抗生素［8］。在新型農(nóng)用抗生素的分離篩選過程中，從土壤中篩選到一株黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii），經(jīng)離體生測發(fā)現(xiàn)其對(duì)西瓜枯萎病菌和水稻紋枯病菌具有極強(qiáng)抑制作用［9］。已有研究表明，黃麻鏈霉菌菌株發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌具有較強(qiáng)的室內(nèi)抑制毒力，遠(yuǎn)高于井岡霉素對(duì)水稻紋枯病菌的室內(nèi)抑制毒力［10-11］，但田間防治效果與井岡霉素相當(dāng)。為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了該菌株發(fā)酵液對(duì)多種植物病原真菌的抗菌活性及發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)對(duì)熱、紫外線以及pH值的穩(wěn)定性，以便為S.corchorusiiAUH-1菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，并為該菌株發(fā)酵液中抗真菌組分的分離純化、結(jié)構(gòu)測定及加工儲(chǔ)藏等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii）AUH-1菌株：由本實(shí)驗(yàn)室自行分離篩選獲得，甘油凍存管保存。

供試植物病原真菌：水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、西瓜枯萎 病菌（Fusarium oxysporumf.sp.

niveum）、葡萄座腔病菌（Botryosphaeria dothidea）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotian

ae）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 指示菌培養(yǎng)基：（1）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。（2）高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2-7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40 g，玉米淀粉 20 g，玉米漿 20 g，（NH4）2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，H2O 1000 mL，pH 7.2-7.4。所有培養(yǎng)基在121℃滅菌30 min備用。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵粗提液的制備 黃麻鏈霉菌AUH-1新鮮斜面用1×2 cm規(guī)格的接種鏟挖菌塊，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量：100 mL/500 mL三角瓶），在28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d，收集發(fā)酵液，加入2倍體積工業(yè)酒精浸提48 h，離心，取上清液經(jīng)減壓濃縮至酒精蒸干，濃縮液用0.22 mm無菌微孔濾膜過濾，即為發(fā)酵粗提液，存于4℃冰箱，備用。

1.2.2 發(fā)酵粗提液抗真菌活性測定 采用抑制菌絲生長速率法，將各指示菌株接種至PDA平板上，在28℃下培養(yǎng)7 d，用直徑為6 mm打孔器打取菌落邊緣菌塊作為接種物，接種至含有發(fā)酵粗提液的PDA平板上，以含等量無菌水的PDA平板為對(duì)照，培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測定菌落大小，按公式算出菌絲生長抑制率。

1.2.3 發(fā)酵粗提液中抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性測定 溫度穩(wěn)定性：取10 mL發(fā)酵粗提液放入50 mL離心管內(nèi)，分別置于60、70、80、90、100、115和121℃條件下處理30 min。以水稻紋枯病菌作為指示菌，設(shè)無菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。參照1.2.2方法測定其抑制率，根據(jù)抑制率變化情況來確定其熱穩(wěn)定性。

紫外穩(wěn)定性：吸取發(fā)酵粗提液5 mL至無菌培養(yǎng)皿中，敞口放置在距15 W紫外燈30 cm處，在此條件下分別處理5、10、20、30、40和50 min后將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)。紫外穩(wěn)定性的菌絲生長抑制率測定方法同上。

酸堿穩(wěn)定性：取10 mL發(fā)酵粗提液至50 mL離心管中，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調(diào)整發(fā)酵液 pH值至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫下靜置過夜，然后將發(fā)酵液pH值調(diào)回其原始pH 5.17。酸堿穩(wěn)定性的菌絲生長抑制率測定方法同上。1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，origin 9.0和DPS 7.05進(jìn)行作圖和差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵粗提液抗真菌活性

用抑制菌絲生長速率法測試S.corchorusiiAUH-1菌株發(fā)酵粗提物對(duì)供試植物病原真菌的抑制作用，結(jié)果如表1和圖1所示。S.corchorusiiAUH-1菌株發(fā)酵粗提物對(duì)8種植物病原真菌都有不同程度的抑制作用，其中對(duì)西瓜枯萎病菌、煙草黑脛病菌、水稻紋枯病菌以及辣椒疫病菌的抑制效率分別高達(dá)81%、78%、68%和67%以上，對(duì)葡萄座腔病菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌和黃瓜枯萎病菌的抑制效果較差，但抑制率也達(dá)到24%以上。因此，該菌具有廣譜的抗真菌活性。

表1 黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵粗提液抗植物病原真菌的生測結(jié)果

2.2 發(fā)酵粗提液中抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.2.1 溫度穩(wěn)定性 溫度對(duì)黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵粗提液抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響如圖2所示。在60℃以上溫度進(jìn)行熱處理，均會(huì)降低發(fā)酵粗提液中抗真菌活性物質(zhì)的抑菌活性。其中，60-80℃熱處理下的水稻紋枯病菌抑制率差異不顯著，抑菌率值保持在53.64%-57.47%之間。進(jìn)一步提高熱處理溫度，黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵粗提液的水稻紋枯病菌抑制率出現(xiàn)顯著下降。值得注意的是，即使經(jīng)100℃以上熱處理30 min，黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵粗提液仍保持一定的抗真菌活性，100、115和121℃三種溫度下的水稻紋枯病菌抑制分別為23.04%、5.29%和3.6%。由此可見，黃麻鏈霉菌AUH-1所產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。

1，2：西瓜枯萎病菌對(duì)照和處理；3，4：煙草黑脛病菌對(duì)照和處理；5，6：水稻紋枯病菌對(duì)照和處理；7，8：葡萄座腔對(duì)照和處理；9，10：棉花黃萎病菌對(duì)照和處理；11，12：棉花枯萎病菌對(duì)照和處理；13，14：辣椒疫病菌對(duì)照和處理；15，16：黃瓜枯萎病菌對(duì)照和處理

2.2.2 紫外穩(wěn)定性 用15W紫外燈近距離照射黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵粗提液后，抑菌活性變化情況如圖3所示。紫外照射對(duì)發(fā)酵粗提液中抗真菌活性物質(zhì)抑菌活性的影響不大，即使經(jīng)紫外照射50 min后，對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率仍可達(dá)到51.31%。這說明，黃麻鏈霉菌AUH-1如果作為農(nóng)用抗生素進(jìn)行大田施用，能滿足室外日照條件的影響。

2.2.3 酸堿穩(wěn)定性 如圖4所示，隨pH值的升高，黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵粗提液的抑菌活性呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5時(shí)，水稻紋枯病菌的抑制率為41.08%，隨著pH值繼續(xù)升高，當(dāng)pH值為11時(shí)，水稻紋枯病菌的抑制率從41.08%降至11.33%。對(duì)比不同pH值下的水稻紋枯病菌抑制率發(fā)現(xiàn)，堿處理更易造成黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵粗提液的失活。值得注意的是，當(dāng)發(fā)酵粗提液不經(jīng)任何酸堿處理時(shí)，水稻紋枯病菌的抑制率達(dá)到68.25%，反而顯著高于1、3、5、7、9、11的酸堿處理。由此可見，黃麻鏈霉菌AUH-1所產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)不耐受酸堿。

3 討論

農(nóng)用抗生素作為一種由微生物產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，無論是施用到作物表面還是進(jìn)入植物根際土壤，均易受到室外光照、溫度等外界條件的影響。目前，關(guān)于農(nóng)用抗生素酸堿、熱、紫外等處理下的穩(wěn)定性研究已有大量報(bào)道，而且多種抗生素物質(zhì)展現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。趙娟等［12］從極端沙漠環(huán)境分離篩選到一株高活性拮抗放線菌XJ93，通過室內(nèi)殺菌活性測定發(fā)現(xiàn)其具有較廣譜的抗真菌活性，發(fā)酵液在80℃及以下溫度處理1 h仍保持較高的抑菌活性（63.51%-70.72%），在pH為1和13條件下，抑制率仍達(dá)到45%以上，并且對(duì)可見光和紫外光具有較好的穩(wěn)定性。

黃麻鏈霉菌（S.corchorusii）代謝產(chǎn)物的生物活性在近幾年才被發(fā)現(xiàn)并開始研究。楊敬輝、陳宏州等［10，13］發(fā)現(xiàn)其活性物質(zhì)對(duì)草莓枯萎病菌及水稻紋枯病菌具有抑制效果。據(jù)吳翔等［14］報(bào)道，其活性物質(zhì)對(duì)纖維素也具有一定的降解能力。Adinarayana等［15］的研究表明，其代謝所產(chǎn)抗生素拒霉素（Resistomycin）和特曲霉素D（Tetracenomycin D）對(duì)人體癌細(xì)胞具有一定的抗腫瘤活性。

本研究通過抑制菌絲生長速率法測定了S.corchorusiiAUH-1的抗真菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，S.corchorusiiAUH-1粗提液對(duì)8種植物病原真菌均具有不同程度的抑制作用，具有廣譜的抗真菌活性，尤其是對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制作用最為強(qiáng)烈，抑制率達(dá)81.81%，另外對(duì)煙草黑脛病菌、水稻紋枯病菌及辣椒疫病菌的抑制效率也高達(dá)65以上。由于供試的植物病菌真菌數(shù)量較少，因此暫不能確定其粗提液對(duì)未測試的病原真菌有無抑菌活性，且關(guān)于其抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)只對(duì)病原真菌在室內(nèi)條件下進(jìn)行離體生測，而對(duì)其在大田試驗(yàn)中的防效是否理想也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究以水稻紋枯病菌為指示菌，對(duì)S. corchorusiiAUH-1粗提液活性物質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行測定。結(jié)果表明，其所產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)對(duì)酸堿敏感，但是具有良好的熱穩(wěn)定性和紫外穩(wěn)定性，為該菌活性物質(zhì)分離純化及產(chǎn)品的加工與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。由此可見，黃麻鏈霉菌AUH-1具有開發(fā)出生物農(nóng)藥的良好應(yīng)用前景，可滿足室外日照、溫度等外界環(huán)境條件的變化，而保持較好的抗植物病原真菌效果。

4 結(jié)論

以水稻紋枯病菌為指示菌，探究了黃麻鏈霉菌AUH-1菌株發(fā)酵液的抗真菌活性，以及溫度、紫外線和pH等理化因素對(duì)其所產(chǎn)活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)8種植物病原真菌都有不同程度的抑制作用，具有廣譜的抗真菌活性，且存在良好的熱穩(wěn)定性和紫外穩(wěn)定性。