高滴度慢病毒制備及其感染人原代T細(xì)胞的條件優(yōu)化*

歐陽寒梅， 羅 丹，王 欣，劉 雯，游 露，代正群，楊 艷，葉鑫宇， 鄒 強Δ

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都610500);2.成都醫(yī)學(xué)院 科研實驗中心 (成都610500)

CAR-T技術(shù)已經(jīng)在癌癥治療中顯示出廣闊的發(fā)展前景，這種方法正在引發(fā)癌癥免疫治療的革命性轉(zhuǎn)變。所謂CAR-T，即使用經(jīng)遺傳修飾的原代T細(xì)胞來表達嵌合抗原受體(CAR)基因，通過使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，mRNA或慢病毒技術(shù)將CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞中穩(wěn)定表達以構(gòu)建CAR-T細(xì)胞，回輸?shù)饺梭w后靶向識別殺傷腫瘤細(xì)胞[1]。到目前為止，全球已經(jīng)有兩款針對血液性惡性腫瘤的自體型CAR-T上市，他們都是通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進T細(xì)胞穩(wěn)定表達，慢病毒對T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是CAR-T技術(shù)的關(guān)鍵性步驟。慢病毒(lentivirus，LV)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，為RNA病毒，包括人免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)等。如今，LV技術(shù)已成為在體內(nèi)外將外源基因傳遞到各種類型細(xì)胞中的最有效工具之一[2-5]。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的優(yōu)點在于不僅能夠感染多種分裂和非分裂細(xì)胞，還可以高效的將目的基因整合到宿主基因組并長期穩(wěn)定表達[6]。LV載體設(shè)計中的許多不同修飾提高了其生物安全性和基因表達的效率。然而，LV的廣泛應(yīng)用依賴于對不同類型細(xì)胞的感染條件的優(yōu)化[7]。其中，人原代T細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)仍然具有挑戰(zhàn)性，并且實現(xiàn)有效基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法通常昂貴且耗時[8]。為了建立高效穩(wěn)定的制備高滴度病毒載體的方法及T細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，本研究擬探究高滴度慢病毒制備條件及T細(xì)胞高效轉(zhuǎn)導(dǎo)條件，以提高T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，進一步為CAR-T療法節(jié)約時間和成本。

1 材料與方法

1.1 材料

LV質(zhì)粒系統(tǒng)：LV載體系統(tǒng)由pLP1、pLP2、pLP-VSVG和pLVX-EGFP組成(美國Thermo Fisher Scientific公司)，pMD2.G，pSPAX2，pWPXL(Addgene公司，美國)。包裝細(xì)胞系：人胚腎細(xì)胞293FT細(xì)胞(美國ATCC公司)。流式細(xì)胞儀(美國ACEA Biosciences公司，Inc)。宿主菌：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌為DH5a(諾唯贊公司，中國)。Jurkat細(xì)胞(美國ATCC公司)。人原代T細(xì)胞(人外周血中提取)。質(zhì)粒無內(nèi)毒素大提試劑盒(德國Qiagen公司，貨號12362)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000 Transfection Reagent(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號L3000-015)，細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM和1640(美國Hyclone公司，貨號SH30243.01B)，細(xì)胞培養(yǎng)血清為胎牛血清(澳洲BOVOGEN公司，貨號SFBS)。細(xì)胞因子IL-2(美國eBioscience公司，貨號11-7021-71)、IL-7和IL-15(德國Cellgenix公司，貨號1413-050)。

1.2 方法

1.2.1 純化質(zhì)粒 將pLP1、pLP2、pLP-VSVG和pLVX-EGFP四質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到DH5a中，涂板后置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h。挑取單個菌落于4 mL含氨芐的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)12 h，然后接150 uL菌液于含氨芐的100 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中震蕩培養(yǎng)12～16 h，然后用QIAGENE 無內(nèi)毒素提取試劑盒純化質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將293FT細(xì)胞按照 1.2×105cells/mL的密度傳代于10 cm培養(yǎng)皿中，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長到80%～90%匯合時轉(zhuǎn)染。

1.2.3 LV包裝和濃縮 1)制備A管：將pLP1、pLP2、pLP-VSVG和pLVX-EGFP四種質(zhì)粒和P3000 Reagent和適量的Opti-MEM混合。2)制備B管：將Lipofectamine 3000 Reagent與適量的Opti-MEM混合。將A管與B管混勻，室溫孵育15～20 min。最后將孵育好的混合液滴加到細(xì)胞匯合度為80%～90%的培養(yǎng)皿中，混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h時收集LV上清液，用0.45 μm的濾膜過濾病毒后用超濾管超濾濃縮病毒。

1.2.4 滴度檢測 Jurkat細(xì)胞以100 000個/孔接種于96孔板中，每孔加100 uL含10%FBS培養(yǎng)基，第1孔中加入待測病毒原液20 uL，此后每孔依次按5∶1倍比稀釋直到稀釋625倍，最后一孔作空白對照。96 h后從測定滴度的孔中取20 uL細(xì)胞稀釋20倍后用流式細(xì)胞儀檢測器通道FL-1檢測EGFP熒光表達率。病毒滴度計算：陽性率×細(xì)胞/孔×1 000/加入的病毒體積。

1.2.5 LV轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞 采用不同類型的濃縮的和未濃縮的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)不同活化程度下的T細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后96 h檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)效率換算滴度。

1.2.6 包裝系統(tǒng)對LV滴度的影響 采用二代和三代LV包裝系統(tǒng)分別搭配二代和三代LV包裝載體(共4組)制備LV后分別用Jurkat細(xì)胞測定滴度。

1.2.7 啟動子對LV滴度的影響 采用第三代LV包裝系統(tǒng)搭配不同啟動子的LV載體(共兩組)制備LV后用Jurkat細(xì)胞測定滴度。

1.2.8 凍融和在4 ℃置放不同天數(shù)對LV滴度的影響 凍融病毒1、2、3次后用Jurkat細(xì)胞測定滴度(滴度測定/次)；病毒在4 ℃置放5 d，用Jurkat細(xì)胞測定滴度(滴度測定/天)。

1.2.9 磁珠活化T細(xì)胞對LV轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響 用LV分別轉(zhuǎn)導(dǎo)加磁珠活化的T細(xì)胞和不加磁珠活化的T細(xì)胞(共兩組)；用LV感染不同磁珠量活化的T細(xì)胞(共4組)，然后用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

1.2.10 T細(xì)胞活化不同天數(shù)對LV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響 T細(xì)胞活化后不同時相點轉(zhuǎn)導(dǎo)LV(共4組)，然后用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism7軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同LV包裝系統(tǒng)對病毒滴度的影響

二代和三代LV包裝系統(tǒng)搭配不同LV載體pLVX-EGFP和pWPXL制備慢病毒，然后用Jurkat細(xì)胞測定滴度，病毒滴度測定結(jié)果顯示三代LV包裝質(zhì)粒搭配pLVX-EGFP制備病毒滴度較搭配pWPXL高(P<0.05)，二代LV包裝系統(tǒng)搭配pWPXL制備病毒滴度較搭配pLVX-EGFP高(P<0.05)(圖1)。

圖1二代和三代LV包裝系統(tǒng)搭配二代和三代慢病毒載體制備LV感染Jurkat細(xì)胞滴度

注：與三代慢病毒包裝系統(tǒng)搭配pLVX-EGFP制備的病毒相比較，*P<0.05；與二代慢病毒包裝系統(tǒng)搭配pWPXL包裝的病毒相比較，*P<0.05

2.2 不同啟動子對病毒滴度的影響

采用相同LV載體pLVX-EGFP，不同啟動子EF-1a和CMV搭配三代LV包裝質(zhì)粒制備慢病毒感染T細(xì)胞，結(jié)果顯示EF-1a啟動子感染T細(xì)胞的滴度高于CMV啟動子(P<0.05)，故EF-1a啟動子優(yōu)于CMV啟動子(圖2)。

圖2CMV啟動子和EF-1a啟動子搭配第三代LV包裝系統(tǒng)包裝慢病毒的滴度

注：與CMV啟動子的載體搭配三代慢病毒包裝系統(tǒng)制備的慢病毒相比較，*P<0.05

2.3 病毒反復(fù)凍融和在4 ℃置放不同天數(shù)后對滴度的影響

病毒在4 ℃置放1 d滴度無明顯變化，置放2 d滴度下降46%，置放3 d滴度下降68%。病毒在-80 ℃凍融1次滴度下降8%，凍融兩次滴度下降35%，凍融3次滴度下降71%。病毒在4 ℃置放2 d及以上和凍融兩次及以上與無置放無凍融的病毒原液相比滴度下降較多(P<0.05)，會較大地影響病毒活性，進而影響靶細(xì)胞的感染效率(圖3)。

圖3慢病毒循環(huán)凍融3次和在4℃存儲5d的滴度

注：A：慢病毒循環(huán)凍融3次后分別檢測病毒滴度，與無凍融病毒相比較，*P<0.05；B：慢病毒在4 ℃置放5 d后分別檢測病毒滴度，與無置放的病毒相比較，*P<0.05

2.4 磁珠活化T細(xì)胞對T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響

活化的T細(xì)胞比不活化的T細(xì)胞LV感染率高(P<0.05)，不活化時T細(xì)胞感染率極低，由此推測活化的細(xì)胞有利于促進LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)。磁珠與細(xì)胞的比例在0∶1時感染率極低，在0.5∶1,1∶1,3∶1時感染率相差不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，故磁珠與細(xì)胞比例在0.5∶1及以上對T細(xì)胞的感染率影響不大(圖4)。

圖4 磁珠活化T細(xì)胞對T轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響

注：A：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)磁珠活化與不活化的T細(xì)胞后檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，與有磁珠活化的T細(xì)胞相比較，*P<0.05；B：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)不同量的磁珠活化T細(xì)胞后檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

2.5 T細(xì)胞活化不同時相點轉(zhuǎn)導(dǎo)LV對轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響

分別在T細(xì)胞活化后0、24、48、72 h轉(zhuǎn)導(dǎo)LV，結(jié)果顯示T細(xì)胞活化后24 h滴度較高，48、72 h滴度呈逐漸降低趨勢，故活化后24 h為較佳感染時相點(P<0.05)(圖5)。

圖5 T細(xì)胞活化后不同時相點的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

注：分別在T細(xì)胞活化后0、24、48、72 h轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒，與0、48、72 h相比較，*P<0.05

3 討論

研究結(jié)果顯示三代LV包裝質(zhì)粒搭配三代LV載體pLVX-EGFP和二代LV包裝質(zhì)粒搭配二代LV載體pWPXL病毒滴度較高，其中三代LV包裝質(zhì)粒搭配pLVX-EGFP病毒滴度較高。且三代LV載體較二代安全性更高，因為三代在二代的基礎(chǔ)上刪除了病毒tat基因，該基因?qū)σ吧腿祟惷庖呷毕莶《?型(HIV-1)的復(fù)制至關(guān)重要；為了降低質(zhì)粒擴增和病毒載體制備過程中重組的風(fēng)險，將載體包裝功能分成三個獨立的質(zhì)粒而不是兩個質(zhì)粒。改變3′LTR使載體“自失活”，以防止整合基因被重新包裝；用異源外殼蛋白VSV-G代替天然HIV-1包膜蛋白，這些改造都使三代安全性更高，且三代滴度較二代高，因此推薦使用三代慢病毒包裝系統(tǒng)。

CMV啟動子和EF-1a啟動子為載體中最常用的啟動子，故本研究對比了二者對慢病毒表達效率的影響。研究結(jié)果顯示，相同載體不同啟動子(CMV啟動子和EF-1a啟動子)搭配LV包裝質(zhì)粒制備病毒，用Jurkat細(xì)胞檢測病毒滴度，EF-1a啟動子包裝的病毒滴度及表達效率都高于CMV啟動子，在T細(xì)胞上的表達結(jié)果亦是如此。Teschendorf C等的研究結(jié)果顯示用EF-1α啟動子產(chǎn)生穩(wěn)定的HT-29克隆，其中>97%的所有細(xì)胞均勻地表達GFP。相反，在攜帶CMV啟動子的克隆中，僅高達60%的細(xì)胞是GFP陽性的，細(xì)胞之間的表達水平變化很大。在體內(nèi)，攜帶EF-1α啟動子的腫瘤是均一的GFP陽性，而CMV啟動子產(chǎn)生GFP表達呈散在的分布模式[9]。但是研究[10]結(jié)果表明在293T細(xì)胞上表達綠色熒光蛋白，CMV啟動子優(yōu)于EF-1a啟動子。分析原因可能是由于不同啟動子在不同細(xì)胞中驅(qū)動活性不一致，提示基因表達研究時應(yīng)選取適宜的啟動子以驅(qū)動目的基因的高效表達，本研究結(jié)果顯示當(dāng)目的基因在T細(xì)胞上表達時適宜選用EF-1a啟動子。

LV收集和濃縮后的保存也是影響病毒活性的一個重要條件。研究[11]結(jié)果表明當(dāng)病毒在4 ℃(t=1.3 d)儲存或經(jīng)歷多次凍融循環(huán)(t= 1.1輪)時，濃縮和非濃縮慢病毒的感染效率迅速降低。因此本研究探索了病毒在4 ℃儲存不同天數(shù)和在-80 ℃反復(fù)凍融滴度下降的具體情況。LV在4 ℃儲存2 d病毒滴度下降46%，-80 ℃凍融兩次滴度下降35%，進而導(dǎo)致病毒活性大大降低，進一步影響靶細(xì)胞感染率。因此不建議病毒反復(fù)凍融和在4 ℃儲存太長時間，在4 ℃儲存1 d和在-80 ℃凍融1次LV滴度下降低于10%，是可接受的范圍。

本研究結(jié)果顯示T細(xì)胞活化與否決定了LV能否轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。成熟的成人T細(xì)胞可分為2個不同的亞群，即記憶和幼稚T細(xì)胞。天然T細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞尤其重要，因為它們保持對新抗原的反應(yīng)能力。同樣至關(guān)重要的是，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進T細(xì)胞后不會顯著改變T細(xì)胞對抗原的反應(yīng)。現(xiàn)在普遍認(rèn)為構(gòu)成體內(nèi)大部分循環(huán)T細(xì)胞庫的靜息T細(xì)胞不能通過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-14]。慢病毒載體LV可以轉(zhuǎn)導(dǎo)許多類型的非增殖細(xì)胞，除了一些特定的靜止細(xì)胞類型，例如靜息T細(xì)胞和B細(xì)胞。到目前為止，盡管對阻礙LV轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止細(xì)胞的限制條件有廣泛的了解，但設(shè)計能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止淋巴細(xì)胞的VSVG-LV還是不可能的[15]，除非通過T細(xì)胞受體(TCR)或存活細(xì)胞因子誘導(dǎo)他們進入細(xì)胞周期的G1期，否則逆轉(zhuǎn)錄(RT)，核輸入以及隨后的水泡性口炎病毒G蛋白假型LV(VSVG-LV)基因組的整合都不會發(fā)生[16]。據(jù)報道[17-19]，誘導(dǎo)靜息T細(xì)胞進入細(xì)胞周期的G1b期而不引發(fā)細(xì)胞分裂可使它們允許用HIV-1載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究利用CD3/CD28磁珠及IL-2、IL-15等細(xì)胞因子刺激活化T細(xì)胞，結(jié)果顯示LV在T細(xì)胞上的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大大提高，提示CD3/CD28磁珠及IL-2、IL-15等細(xì)胞因子刺激T細(xì)胞有利于促進T細(xì)胞進入G1期，從而提高T細(xì)胞的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

T細(xì)胞活化后較佳轉(zhuǎn)導(dǎo)時相點的探索過程中，本研究前期結(jié)果表明靜息的T細(xì)胞不能被LV感染，通過CD3/CD28磁珠及IL-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)T細(xì)胞進入G1期才能被LV轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，本研究進一步探索了T細(xì)胞活化后大多數(shù)細(xì)胞進入G1期的時相點，以進一步提高T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本研究在T細(xì)胞活化后0、24、48、72 h分別轉(zhuǎn)導(dǎo)LV，結(jié)果顯示0～24 h時轉(zhuǎn)導(dǎo)效率逐漸上升，24 h以后轉(zhuǎn)導(dǎo)效率呈遞減趨勢，因此確定了T細(xì)胞活化后24 h為較佳轉(zhuǎn)導(dǎo)時相點，可以推測此時絕大部分細(xì)胞已經(jīng)進入G1期，能夠被LV轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，在慢病毒包裝時適宜選用三代慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒包裝載體適宜選用EF-1a啟動子的載體。制備好的病毒最多允許凍融一次和在4 ℃儲存一天，反復(fù)凍融超過兩次或在4 ℃儲存時間超過一天病毒滴度下降較多，從而影響病毒活性，進一步影響靶細(xì)胞的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。T細(xì)胞活化后24 h LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高。