基于高通量測序技術(shù)分析牛欄山大曲微生物多樣性

王 勇，周 森，魏金旺*

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司 牛欄山酒廠，北京101301）

牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒，憑借清香純正、口味甘冽、酒體醇厚等特點(diǎn)，逐漸成為我國北方清香型的代表性白酒之一，在國內(nèi)具有較高的知名度[1-2]。牛欄山二鍋頭主要以大曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過糖化、發(fā)酵、蒸餾和儲(chǔ)存等步驟制得。大曲是二鍋頭釀造中的主要糖化劑，是富含微生物菌系、酶系和曲香物質(zhì)的微生態(tài)制品，具有糖化、發(fā)酵、生香等功能[3]，是白酒中微生物的主要來源。然而傳統(tǒng)微生物分離方法對(duì)大曲中微生物的研究還有一定的缺陷，大曲中的微生物經(jīng)過長期的馴化，早已適應(yīng)了高溫、低含水量及不同pH值等特殊環(huán)境，而在人工培養(yǎng)模式下，由于培養(yǎng)條件難以完全模擬出大曲的制曲環(huán)境，往往會(huì)造成部分微生物無法正常生長，導(dǎo)致微生物可培養(yǎng)性不高等現(xiàn)象[4]。

目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及運(yùn)用，人們對(duì)大曲微生物菌系的研究逐漸由傳統(tǒng)微生物分離轉(zhuǎn)變?yōu)橐揽糠肿由飳W(xué)技術(shù)的免培養(yǎng)方法。近幾年來，以基因文庫、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、高通量測序?yàn)橹鞯姆肿由飳W(xué)技術(shù)手段逐漸應(yīng)用于大曲微生物的研究中，有效解決了純培養(yǎng)技術(shù)在微生物分離種類和數(shù)量方面的不足[5-8]，如羅惠波等[9]利用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）基因文庫研究了清香型大曲真菌群落結(jié)構(gòu)，確定出汾酒大曲真菌全部屬于酵母目和毛霉菌目，清茬、后火和紅心曲真菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異；蘭玉倩等[10]利用PCR-DGEE技術(shù)解析清香型大曲生產(chǎn)過程中酵母群落結(jié)構(gòu)，確定了清香型大曲制作過程中存在7個(gè)真菌分類屬，并介紹了各屬微生物的變化規(guī)律；喬曉梅等[11]采用高通量測序法分析了清香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)，確定了清香大曲主要真菌類群。這些研究方法可以避免在傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中富集、培養(yǎng)及分離等步驟中所造成的微生物多樣性丟失、種群構(gòu)成發(fā)生變化等局限，能夠更直接可靠的反映樣品微生物的原始組成情況。

本研究采用高通量測序技術(shù)，利用免培養(yǎng)方法，從牛欄山大曲中原核生物和真核生物兩個(gè)方面入手，系統(tǒng)分析牛欄山大曲菌系組成，同時(shí)根據(jù)不同微生物所占比例關(guān)系，確定出了牛欄山大曲中主體微生物，為牛欄山大曲質(zhì)量控制及制曲工藝提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為牛欄山大曲微生物分離純化等工作提供數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型釀酒生產(chǎn)大曲：取牛欄山不同釀酒班生產(chǎn)大曲，按“四分法”混合取樣[12]，用無菌封口袋封裝，-80 ℃保藏備用；土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）：美國Mpbio公司；DNA引物：北京天跟生化科技有限公司；冰乙酸（分析純）：北京化工廠；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY600型基礎(chǔ)型電泳儀：鄭州博邦科貿(mào)有限公司；ChampGelTM全自動(dòng)凝膠成像儀：北京賽智創(chuàng)業(yè)公司；1-14k高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Illumina MiSeq測序儀：北京奧維森基因科技有限公司；0.45 μm過濾膜：Milipore公司；Milli-Q IQ7000超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；Fast-Prep-24 5G勻漿儀：美國MP Biomedicals公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大曲總DNA提取

從混合大曲樣品中隨機(jī)稱取6份（每份1 g），經(jīng)Fastprep處理后，采用土壤基因組DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for SoiL）提取總DNA。

1.3.2 大曲高通量測序

大曲樣品中微生物種類繁多，真核微生物和原核微生物共存，因此本研究對(duì)大曲樣品總DNA的ITS1區(qū)和16S rDNA V3/V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件見表1。

將6份大曲總DNA混合后，進(jìn)行ITS1區(qū)和16S rDNA V3/V4區(qū)片段擴(kuò)增，產(chǎn)物庫檢合格后，利用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行細(xì)菌、真菌高通量測序（北京奧維森公司）。原始測序序列通過Fastqc進(jìn)行質(zhì)量檢測去除低質(zhì)量Reads（過濾標(biāo)準(zhǔn)：Q20≥90%）。通過Cope軟件（Connecting Overlapped Pair-End，V1.2.3.3），進(jìn)行序列拼接及過濾后利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法（average neighbor clustering algorithm）在0.03（或97%的相似度）水平下對(duì)Clean Tags進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的聚類，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品每個(gè)OTU中的豐度信息。選取分析數(shù)據(jù)中每個(gè)OTU中一個(gè)有代表性的序列，通過Blast比對(duì)，獲得每一個(gè)OTU種名。

表1 高通量測序引物序列Table 1 Primer sequences of high throughput sequencing

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲微生物聚類分析

大曲總DNA經(jīng)電泳檢測合格后，利用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行細(xì)菌、真菌高通量測序，根據(jù)97%相似度將不同測序序列進(jìn)行聚類分析。經(jīng)分析表明，從牛欄山大曲中共獲得真核OTU 69種，原核OTU 358種，說明牛欄山大曲中原核微生物多樣性遠(yuǎn)高于真核。

2.2 大曲原核微生物多樣性

樣品中原核微生物358 種OTU 主要由放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4類組成，其具體分布見表2。

表2 大曲原核微生物分類Table 2 Classification of prokaryotic microorganism from Daqu

通過表2可以看出，大曲中厚壁菌門所占OTU數(shù)量最多，為46.65%，變形菌門和放線菌門分別為25.42%和21.79%，擬桿菌門數(shù)量最少，為6.15%。同時(shí)，對(duì)所獲得OTU進(jìn)一步進(jìn)行種屬分析，結(jié)果見圖1所示。

通過對(duì)358種原核OTU進(jìn)行種屬比對(duì)，挑選OTU數(shù)占原核總OTU數(shù)1%以上的序列進(jìn)行多樣性分析。如圖2所示，共有14種OTU占1%以上，其總和可占總OTU的83%，因此可以認(rèn)為14種OTU能夠代表大曲主體原核微生物。

圖1 大曲原核微生物種屬分布餅圖Fig. 1 Species distribution pie chart of prokaryotic microorganism from Daqu

14種OTU的菌屬主要可分為乳酸菌、放線菌、芽孢桿菌、葡萄球菌這4大類，其中乳酸菌種類較多，由7種組成，放線菌、芽孢桿菌和葡萄球菌種類較為接近，均為2～3種。在種屬分布上，乳酸菌所占比例較多，維斯氏菌（Weissella confusa）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）和戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）分別占大曲總OTU的22.68%、16.54%和9.84%；放線菌（Kroppenstedtia eburnea）可在大曲中占14.78%；以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）為主的芽孢桿菌僅占3.80%和2.14%。整體看來，牛欄山大曲中優(yōu)勢原核微生物較為明顯，乳酸菌類在牛欄山大曲中占據(jù)了主導(dǎo)地位，同時(shí)含有一定量的高溫放線菌，而芽孢桿菌則在大曲中含量較低。在牛欄山酒釀造過程中，大曲中的大量乳酸菌進(jìn)入到發(fā)酵過程中能夠?yàn)榘l(fā)酵微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)并維持發(fā)酵的平衡。目前已有研究表明，乳酸菌自身可以合成一類具有活性的多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，呈現(xiàn)不可逆的殺菌作用方式，有效地抑制酒醅中雜菌生長[14]，另外當(dāng)乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵時(shí)，能夠有效地提高發(fā)酵樣品中的酸、醇、酯等風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量；同時(shí)乳酸菌自溶所產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)可供酵母所利用，自溶后產(chǎn)生的酶類、活性成分和多種酸性多糖磷酸質(zhì)，具有一定的糖化作用，在一定程度上提高了酒醅其余微生物對(duì)淀粉的利用[15-16]；并且其產(chǎn)生的多種有機(jī)酸是乳酸乙酯及其他香味成分合成的重要基礎(chǔ)物質(zhì)。

2.3 大曲真核微生物多樣性

在本研究中，共獲得真核微生物OTU 69種，共分為9個(gè)目，其具體組成見表3。

通過表3可以看出，牛欄山大曲中酵母目OTU所占比例最多，達(dá)到了56.52%，其次為散囊菌目15.94%，毛霉菌目8.70%，其余類別所占比例相對(duì)較低。對(duì)所獲得OTU數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行種屬分析。通過對(duì)69種OTU進(jìn)行種屬比對(duì)，挑選OTU數(shù)量前10的OTU進(jìn)行系統(tǒng)分析，如圖2所示。

表3 大曲真核微生物分類Table 3 Classification of eukaryotic microorganism from Daqu

圖2 大曲真核微生物種屬分布餅圖Fig. 2 Species distribution pie chart of eukaryotic microorganism from Daqu

由圖2可知，在大曲真菌OTU中，前10種OTU總和可占大曲真菌總OTU的99.25%，因此可以認(rèn)為這10種OTU能夠真實(shí)反映大曲中真菌的種屬分布情況。在大曲真菌種屬組成中，扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）數(shù)量最多，可占大曲真菌總量的73%，其次為庫氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）可占21%，兩種真菌共占大曲總量的94%，因此可以認(rèn)為這兩種菌是牛欄山大曲的主體真菌，而其余真菌，如假絲酵母（Candida tropicalis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、橫梗霉（Lichtheimia corymbifera）以及異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等，雖然在大曲高通量中能夠檢測到，但所占比例較低，僅在1%以下，在大曲真菌中并不占優(yōu)勢?？勰腋材そ湍副徽J(rèn)為是清香型大曲制曲前期的主要微生物，雖然其產(chǎn)酒精能力不強(qiáng)，但香味濃郁，可使白酒風(fēng)味更加豐富，同時(shí)已有研究表明，扣囊覆膜酵母能產(chǎn)α-淀粉酶，能分解生料和熟料淀粉，也能產(chǎn)生糖化酶，將淀粉分解為葡萄糖[17-18]，說明扣囊覆膜酵母在制曲過程中可以利用生料淀粉產(chǎn)生糖化酶、淀粉酶，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，為大曲的正常制作提供多種糖類物質(zhì)，同時(shí)也是成品曲中酶類的重要產(chǎn)生菌；庫氏畢赤酵母屬于生香酵母類，在產(chǎn)酯產(chǎn)香方面具有較強(qiáng)能力，能夠利用發(fā)酵環(huán)境中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)及醇類物質(zhì)，在發(fā)酵前期生成大量以乙酸乙酯為主體的酯類及少量酸類、酚類等化合物，起到為基酒增香的重要作用[19-20]。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)，從分類學(xué)角度系統(tǒng)研究了牛欄山大曲真核和原核微生物多樣性分布，確定了大曲中菌系組成。結(jié)果表明原核生物在大曲中多樣性遠(yuǎn)高于真核，共獲得358種原核OTU，而真核僅為69種。微生物種屬分布表明，大曲中原核微生物主要可分為乳酸菌類群、放線菌類群、芽孢桿菌類群和葡萄球菌類群，其中乳酸菌類群所占比例較高，維斯氏菌（W.confuse）、耐酸乳桿菌（L. acetotolerans）和戊糖片球菌（P. pentosaceus）3種乳酸菌總和可占大曲原核總OTU的49.06%，同時(shí)大曲中還存在一定量的高溫放線菌（K.eburnea）；在真核微生物組中，扣囊覆膜酵母（S.fibuligera）和庫氏畢赤酵母（P.kudriavzevii）是牛欄山大曲中的主要微生物，橫梗霉（L.corymbifera）、釀酒酵母（S.cerevisiae）及異常維克漢姆酵母（W.anomalus）、假絲酵母（C.tropicalis）所占比例較低。

大曲制作過程繁雜，培養(yǎng)周期長，在開放的環(huán)境中，其所包含的微生物種類十分豐富，制曲原料、器具、空氣均是大曲微生物的主要來源。牛欄山大曲采用了低溫制曲工藝，制曲溫度最高不超過40～50 ℃，適宜的溫度、制曲工藝及獨(dú)特菌群環(huán)境形成了牛欄山大曲特有的菌群結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)牛欄山大曲進(jìn)行系統(tǒng)研究，將有助于解析出二鍋頭酒口味甘洌、酒體醇厚的原因，同時(shí)也可以為今后大曲的質(zhì)控及強(qiáng)化制曲等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。