基于響應(yīng)面法優(yōu)化咖啡乳酒發(fā)酵工藝

沈燕萍，王 琪，劉琨毅*，鄒 偉，夏熙洋

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學院 五糧液技術(shù)學院，四川 宜賓644003；2.四川理工學院生物工程學院，四川 自貢643000；3.宜賓市三中，四川 宜賓644000）

目前，市面上大部分的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，傳統(tǒng)的乳酒是在鮮奶中加入天然發(fā)酵劑，經(jīng)自然發(fā)酵形成，但因傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝制約，使乳酒產(chǎn)品的質(zhì)量經(jīng)常出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象[1-4]。隨著消費者對健康食品要求的不斷提高，市場急需將這種傳統(tǒng)飲品工業(yè)化生產(chǎn)，其中發(fā)酵劑在乳酒的加工過程中起著至關(guān)重要的作用[5-8]。根據(jù)文獻報道，制備乳酒時使用兩種及兩種以上菌種可以提高產(chǎn)品質(zhì)量，當酵母菌聯(lián)合乳酸菌，且酵母菌與乳酸菌的比例為2∶1時，乳酒的品質(zhì)得到明顯提升[9-12]。開菲爾菌是傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品開菲爾的發(fā)酵劑，開菲爾不僅有著與普通酸牛奶同樣的營養(yǎng)價值，而且具有一定的保健功能[13-16]。

復(fù)合型發(fā)酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發(fā)酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點與優(yōu)勢，彌補利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營養(yǎng)成分不足等缺陷[17-18]。因復(fù)合型發(fā)酵酒利用了多種釀造原料，并采用先進的釀造工藝，使其風味獨特，深受消費者的喜愛[8，16-18]?？Х蕊L味濃郁，具有獨特的花香味、果香味、草香味且功效獨特，正在逐步成為時下的流行飲品[19-21]。

因此，本試驗以開菲爾菌（Kefir）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發(fā)酵劑，通過咖啡與牛奶混合發(fā)酵釀造乳酒，利用單因素試驗及響應(yīng)面試驗對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，以期釀出的酒體風味突出、口感幼滑、酸度適中的咖啡乳酒，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

開菲爾菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）滬釀2.069：宜賓職業(yè)技術(shù)學院菌種保藏中心；咖啡（雀巢）、純牛奶（伊利）、白砂糖：宜賓大潤發(fā)超市；冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：湖北鑫潤德化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：南京試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；次甲基藍（指示劑）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FA20043型電子天平：上海越平科學儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機：鄭州長城工貿(mào)有限公司；MC-GNP-9080系列隔水式恒溫培養(yǎng)箱：青島明成環(huán)?？萍加邢薰荆籇SX-280A型不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；KL-30-10000型乳化均質(zhì)機：上?？苿跈C械設(shè)備有限公司；BCD-2HBSA型電冰箱：青島海爾股分有限公司；PHs-3c型精密pH計：上海理達儀器廠；AT6000型酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 咖啡乳酒釀造工藝流程及操作要點

牛奶、咖啡、白砂糖、亞硫酸鈉→攪拌→過濾→加熱→均質(zhì)→殺菌→冷卻→接入開菲爾菌與釀酒酵母→發(fā)酵→后熟→成品

操作要點：在牛奶中添加一定比例的咖啡、白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，利用檸檬酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6.5，攪拌至白砂糖完全溶解，過濾后加熱至55～65 ℃，采用乳化均質(zhì)機（壓力為15 MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在90～95 ℃條件下加熱殺菌5 min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入一定量的經(jīng)活化后的酵母菌懸液和1%的開菲爾菌，25 ℃條件下發(fā)酵，待發(fā)酵完成后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。

1.3.2 理化指標測定方法[22]

總糖含量（以葡萄糖計）測定：斐林試劑法；酒精度測定：密度瓶法；總酸含量測定：電位滴定法；氨基酸態(tài)氮含量測定：甲醛滴定法。

1.3.3 感官評價

感官評價在學院食品品評室內(nèi)完成，邀請13位教師及實驗員組成評定小組，明確感官評定的指標和注意事項。參照王璐等[2]及GB/T 23546—2009《奶酒》[22]從色澤、組織形態(tài)、香氣、滋味、典型性5個方面制定咖啡乳酒感官評價標準，滿分為100分，評價標準如表1所示。

表1 咖啡乳酒的評分標準Table 1 Evaluation standards of coffee koumiss

續(xù)表

1.3.4 咖啡乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化單因素試驗

白砂糖添加量對咖啡乳酒感官品質(zhì)的影響：在牛奶中加入1.2%的咖啡后煮沸，分別加入4%、6%、8%、10%、12%的白砂糖，加入0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.3%的釀酒酵母及1%的開菲爾菌，25 ℃條件下發(fā)酵4 d后分別記錄咖啡乳酒的感官特征，以確定最佳的白砂糖添加量。

同理，依次考察咖啡添加量（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、釀酒酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發(fā)酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）對咖啡乳酒感官評分的影響，以確定較佳的咖啡添加量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時間。

1.3.5 咖啡乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取白砂糖添加量（A）、咖啡添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發(fā)酵時間（D）為考察因素，以感官評分（Y）為評價指標，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，進行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，確定咖啡乳酒最佳的發(fā)酵工藝條件，因素與水平見表2。

表2 咖啡乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of coffee koumiss

1.3.6 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用OriginPro 9.1軟件進行數(shù)據(jù)制圖和統(tǒng)計分析。采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

圖1 白砂糖添加量對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of coffee koumiss

2.1.1 白砂糖添加量對咖啡乳酒感官評分的影響由圖1可知，當咖啡乳酒中白砂糖添加量從4%增加到10%時，咖啡乳酒的感官評分也隨之增加；當添加量達到10%時，咖啡乳酒的感官評分達到最高分，為（83.1±1.0）分。但隨著白砂糖添加量的繼續(xù)增加，咖啡乳酒的感官評分開始呈現(xiàn)下降的趨勢。糖分在咖啡乳酒發(fā)酵過程中主要轉(zhuǎn)化為乙醇，也可以轉(zhuǎn)化成酸類、酯類、醛類等物質(zhì)[8]，咖啡乳酒在發(fā)酵過程中，可發(fā)酵性糖過少會出現(xiàn)酒體不豐滿、香味不足的現(xiàn)象，可發(fā)酵性糖過多則會造成酒體酸度偏大等不良現(xiàn)象。故選用白砂糖添加量為8%、10%及12%用于后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.2 咖啡添加量對咖啡乳酒感官評分的影響

圖2 咖啡添加量對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 2 Effect of coffee addition on sensory evaluation of coffee koumiss

由圖2可知，咖啡能顯著改善乳酒的風味特征（P＜0.05），不僅能克服乳酒香味不夠豐滿的缺點，而且能賦予乳酒獨特的香醇?？Х热榫频母泄僭u分隨著咖啡添加量的增加而呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，當咖啡添加量為1.2%時，咖啡乳酒的感官評分達到最高，為（82.5±0.7）分。因咖啡含有一定量的苦味物質(zhì)，故咖啡加入量過大會導致咖啡乳酒呈現(xiàn)出較強的苦味，因此，當咖啡添加量適當時才能賦予咖啡乳酒特殊的風味及口感。由此選擇0.8%、1.2%、1.6%的咖啡添加量進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.3 釀酒酵母接種量對咖啡乳酒感官評分的影響

圖3 釀酒酵母接種量對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on sensory evaluation of coffee koumiss

由圖3可知，隨著釀酒酵母接種量的不斷增加，咖啡乳酒的感官評分也隨之不斷增加。當釀酒酵母接種量為0.5%時，咖啡乳酒的感官評分達到最高，為（83.5±1.0）分。酵母菌在發(fā)酵過程中能將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時還會產(chǎn)生一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[12]。當酵母菌接種量較低時，容易使釀酒原料不完全發(fā)酵，造成咖啡乳酒的酒度偏低、酒香不突出等現(xiàn)象。當酵母菌的接種量為0.4%時，咖啡乳酒的感官評分雖然較釀酒酵母接種量為0.5%時低，但兩者并無顯著性差異（P＞0.05）。所以選擇酵母菌接種量為0.3%～0.5%進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.4 發(fā)酵時間對咖啡乳酒感官評分的影響

圖4 發(fā)酵時間對咖啡乳酒感官評分的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of coffee koumiss

由圖4可知，當咖啡乳酒的發(fā)酵時間為3 d時，咖啡乳酒的感官評分最高，為（87.1±0.7）分。當發(fā)酵時間＜3 d之前，可發(fā)酵性糖類還未完全被酵母菌所利用，酒體略顯寡淡，香味不濃郁。當發(fā)酵時間＞3 d之后，咖啡乳酒的酸度開始逐漸增大、苦味開始逐漸變淡，破壞了酒體的風味。其原因可能是開菲爾菌在長時間發(fā)酵過程中產(chǎn)生了大量的乳酸，咖啡中的苦味物質(zhì)被微生物逐漸分解代謝。因此，選擇發(fā)酵時間為2～4 d進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2 咖啡乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以咖啡乳酒的感官評分（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，通過Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面法試驗，考察白砂糖添加量（A）、咖啡添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發(fā)酵時間（D）4個因素對咖啡乳酒感官評分的影響，響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 咖啡乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of coffee koumiss

經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到咖啡乳酒感官評分的回歸方程：

Y=87.52+0.38A+0.15B-0.30C+1.57D+0.97AB+0.08AC+2.25AD-0.35BC+0.62BD-2.18CD-3.32A2-2.44B2-2.92C2-2.79D2

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極為顯著（P＜0.01），且失擬項檢驗不顯著（P＞0.05），表明未知因素對試驗結(jié)果的干擾較小，該試驗?zāi)Ｐ统浞謹M合試驗數(shù)據(jù)，可以用于確定咖啡乳酒釀造的最佳工藝。4個因素對咖啡乳酒感官評分影響的主次順序依次為D＞A＞C＞B，即發(fā)酵時間＞白砂糖添加量＞釀酒酵母接種量＞咖啡添加量，其中二次項A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項D和交互項AD、CD對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項則對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

根據(jù)咖啡乳酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，因素A與因素D之間以及因素C與因素D之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭，即因素A與因素D以及因素C與因素D之間具有最強的交互作用。

通過Design Expert 8.0.6軟件分析確定咖啡乳酒的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量10.49%、咖啡添加量1.26%、釀酒酵母接種量0.38%及發(fā)酵時間3.49 d，在此優(yōu)化條件下，咖啡乳酒感官評分的理論值為89.0分。為便于實際操作，將咖啡乳酒的最佳發(fā)酵工藝條件修訂為白砂糖添加量10.5%、咖啡添加量1.3%、釀酒酵母接種量0.4%及發(fā)酵時間3.5 d，在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，驗證得到咖啡乳酒的感官評分為（88.9±1.1）分，與理論值相近，證明該結(jié)果合理可靠。

圖5 各因素交互作用對咖啡乳酒感官評分的響應(yīng)面曲線及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of coffee koumiss

2.3 理化指標分析

在最佳發(fā)酵工藝條件下得到的咖啡乳酒在的總糖含量為14.3 g/L、酒精度為3.2%vol、總酸含量為6.4 g/L、氨基酸態(tài)氮含量為0.18 g/L。咖啡乳酒的理化指標均符合國標GB/T 23546—2009《奶酒》[22]的標準。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對咖啡乳酒的發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，確定其最優(yōu)發(fā)酵工藝條件：在牛奶中添加1.3%的咖啡、10.5%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，攪拌至白砂糖完全溶解，過濾后加熱至55～65 ℃，進入乳化均質(zhì)機（壓力為15 MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在90～95 ℃加熱殺菌5 min，冷卻后在無菌條件下接入0.4%經(jīng)活化后的釀酒酵母菌懸液和1%的開菲爾菌，25 ℃條件發(fā)酵3.5 d后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。此優(yōu)化條件下獲得的咖啡乳酒的色澤褐黃透明，咖啡香、奶香與酒香和諧，酒體豐滿圓潤的咖啡乳酒，其感官評分為88.9分。