不同陳釀期松針酵素營(yíng)養(yǎng)素變化規(guī)律及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

李 彥，周文化*，羅奡劼，陳露茜，劉裕龍，譚越兮

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410004；3.湖南恩松生物科技有限公司，湖南 湘潭411100）

松針（Pinus armandi Franch）為松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的葉，其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，不僅含有蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素，還含有酚類化合物、揮發(fā)油、莽草酸等大量活性物質(zhì)，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抗衰老、消炎抑菌等[1]作用。

酵素產(chǎn)品是指通過多種有益菌發(fā)酵新鮮果蔬、菌菇、中草藥等得到的液態(tài)食品[2]。在發(fā)酵體系中，各物質(zhì)之間的相互作用，不僅保留了發(fā)酵原液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且通過微生物代謝作用產(chǎn)生了新的活性物質(zhì)，使得產(chǎn)品含豐富的維生素、酶、礦物質(zhì)和次級(jí)代謝產(chǎn)物[3]。這些活性物質(zhì)能起到抗氧化[4-5]、美白[6]、增強(qiáng)免疫力[7]、抗腫瘤[8-9]、降膽固醇[10-11]以及改善肥胖[12-13]的功效。

酵素陳釀期間，各分子經(jīng)氧化還原、酯化、縮合、聚合等一系列反應(yīng)來達(dá)到最佳飲用質(zhì)量[14]，從而提高酵素風(fēng)味和功效。目前，對(duì)酵素的研究大部分集中在工藝優(yōu)化、抗氧化能力、酶活力等方面，如蔣增良等[4]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的葡萄總抗氧化能力增強(qiáng)，且與發(fā)酵體系中多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與代謝有關(guān)；董銀卯等[5]研究了火龍果酵素的體外抗氧化能力以及酶活性，結(jié)果顯示火龍果酵素具有抗氧化、防衰老、增強(qiáng)免疫力的功效。戰(zhàn)偉偉等[15]優(yōu)化了藍(lán)靛果椰子復(fù)合酵素最佳工藝，此工藝得到的酵素品質(zhì)指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；少部分聚焦于探索發(fā)酵初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化規(guī)律，如周偏等[16]研究了諾麗酵素自然發(fā)酵時(shí)品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，而關(guān)于陳釀期酵素營(yíng)養(yǎng)成分變化研究鮮有報(bào)道。本研究以4個(gè)不同陳釀期的松針酵素（不同陳釀期松針酵素的原料組成、加工工藝以及陳釀條件都保持一致）為原料，測(cè)定其主要營(yíng)養(yǎng)成分，分析各組分在陳釀過程中的變化趨勢(shì)及機(jī)理，并利用主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)松針酵素進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步開展松針酵素功能性成分的動(dòng)態(tài)研究及產(chǎn)品質(zhì)量的改善提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同陳釀期（1年、2年、3年、4年）的松針酵素：湖南恩松生物科技有限公司；安琪牌葡萄酒用高活性干酵母、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CECT5716、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）M-16V：中科院微生物研究所；牛血清蛋白（bovineserumalbumin，BSA）（純度＞98%）、葡萄糖（純度＞98%）、沒食子酸（純度＞98%）、蘆?。兌龋?8%）、抗壞血酸（純度＞98%）標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；福林酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNA）、酒石酸鈉、苯酚、無水硫酸鈉、三氯乙酸、磷酸紅菲咯啉（bathophenanthroline，BP）、三氯化鐵（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JE602電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；FB223電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BlueStar B紫外可見分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE28pH計(jì)：梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司；101-3EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；Agilent 240AA火焰原子吸收光譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；S433D氨基酸全自動(dòng)分析儀：德國(guó)Sykam公司；SHDZULC-20AT高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 松針酵素的加工工藝及操作要點(diǎn)

原料→清洗→熱燙→瀝干→研磨→酵母發(fā)酵→混合發(fā)酵→后熟→殺菌→松針酵素

操作要點(diǎn)：選取松針、松花粉、松子、沙棘、柚子、胡蘿卜、菊花、檸檬、橘子、玫瑰花、桂花，用清水洗滌后熱燙15 min，冷卻瀝干后按照1∶10（g∶mL）的比例加水破碎得到混合果漿，磨漿成細(xì)度在0.5～1.2 mm之間，加入混合果漿質(zhì)量22%的紅糖和33%的冰糖，溶解均勻，加入0.8%經(jīng)活化的干酵母，并于22 ℃條件下靜置發(fā)酵18 d，再接種6%發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CECT5716和短雙岐桿菌（Bifidobacterium breve）M-16V的混合菌液（配比1.0∶1.5），發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 d，再轉(zhuǎn)入室溫（25 ℃左右）后熟存放180 d，發(fā)酵結(jié)束后殺菌（60 ℃、30 min）即得松針酵素成品。1.3.2 分析檢測(cè)

（1）理化指標(biāo)的測(cè)定

pH值：pH酸度計(jì)法；總酸（以乙酸計(jì)）含量：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》；可溶性固形物：手持折光儀法；蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)方法[17]；總糖、還原糖含量：DNS顯色法[18]。

（2）多酚含量的測(cè)定

Folin-Ciocalteu比色法[19]測(cè)定，以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.017 7x+0.009 9（R2=0.999 2）計(jì)算樣品中多酚含量。

（3）總黃酮含量的測(cè)定

硝酸鋁比色法[20]測(cè)定，以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=9.9070x+0.0036（R2=0.9994）計(jì)算樣品中總黃酮含量。

（4）維生素含量的測(cè)定

分光光度計(jì)法[21]測(cè)定維生素C（vitamin C，VC），以VC質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制VC標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.030 7x+0.0050（R2=0.998 5）計(jì)算VC含量；維生素B6含量參照國(guó)標(biāo)GB 5009.154—2016《食品中維生素B6的測(cè)定》第一法測(cè)定。

（5）金屬離子的測(cè)定

Ca、K、Na、Mg、Fe含量參照國(guó)標(biāo)GB5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》第一法測(cè)定。

1.3.3 主成分分析

根據(jù)主成分分析方法對(duì)4個(gè)不同陳釀期的松針酵素中的pH、總酸和蛋白質(zhì)等共15個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分變量提取，建立綜合評(píng)價(jià)函數(shù)，得到每個(gè)樣品的綜合得分及排名[22]。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS與Origin數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以及繪制圖表。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，每組數(shù)據(jù)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 松針酵素陳釀期間各營(yíng)養(yǎng)素的變化

2.1.1 松針酵素陳釀期間pH值及總酸含量變化

由圖1可知，1年、2年陳釀期的松針酵素pH變化不大，到第3年、第4年變化較為明顯，由初始值4.33±0.01迅速下降到3.92±0.01后，又以稍緩慢的速度下降到3.76±0.02；總酸含量的整體變化趨勢(shì)是逐漸增加的，與pH變化對(duì)應(yīng)。1年、2年陳釀期的松針酵素總酸含量稍有增加，隨后上升速率變快，質(zhì)量濃度由最初的（6.44±0.15）mg/mL上升到（17.2±0.17）mg/mL，其總量增加了62.49%。引起這種波動(dòng)的原因與自身微生物代謝及發(fā)酵體系的成分有關(guān)，主要原因在于部分發(fā)酵導(dǎo)致蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等緩沖體系破壞引起pH值變化，再者就是陳釀期間微生物代謝將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇、醛、酮、酸，pH下降，總酸含量增加。

圖1 松針酵素陳釀期間pH值及總酸含量變化Fig. 1 Changes of pH value and total acid contents in pine needle enzyme during aging periods

2.1.2 松針酵素陳釀期間蛋白質(zhì)、還原糖及總糖含量變化

由圖2可知，隨著陳釀年份的增加，蛋白質(zhì)含量從188.65μg/mL下降到37.42μg/mL；還原糖含量先由1.69 mg/mL增加到1.90 mg/mL后下降到1.24 mg/mL再趨于平緩；總糖含量由2.76 mg/mL下降到2.08 mg/mL，總體減少了24.64%，總糖含量的變化趨勢(shì)與閻文飛等[23]類似。蛋白質(zhì)、總糖含量第1年先減少，而還原糖含量稍有增加是由于蛋白質(zhì)、總糖營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在陳釀期間被微生物分解利用分別轉(zhuǎn)化為氨基酸和單糖等其他物質(zhì)。從另一個(gè)角度分析，發(fā)酵體系中的游離氨基酸還能與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)物為葡萄糖酸，導(dǎo)致還原糖含量下降。最后1年總糖含量的增加有可能是因?yàn)榻退刂械暮芘c有機(jī)酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，也有可能是因?yàn)闃O微量的糖醇被氧化成葡萄糖。

圖2 松針酵素陳釀期間蛋白質(zhì)、還原糖及總糖含量變化Fig. 2 Changes of protein, reducing sugar and total sugar contents in pine needle enzyme during aging periods

2.1.3 松針酵素陳釀期間VC、黃酮及多酚含量變化

由圖3可知，陳釀期間，VC、黃酮以及多酚含量變化呈一致性，都表現(xiàn)為先增加后減少，且到第2年達(dá)到最大值，其含量分別為166.47 μg/mL、143.17 μg/mL和1.9 mg/mL。出現(xiàn)這種情況的原因有以下幾點(diǎn)，第一，發(fā)酵體系中糖類物質(zhì)被微生物利用逐漸轉(zhuǎn)化成乙醇，隨著乙醇的累積，黃酮及多酚類化合物溶解度增大，原料中的黃酮、多酚大量溶出，含量增加。到陳釀后期，醇類物質(zhì)慢慢氧化成醛，進(jìn)而氧化成酸，一方面，乙醇含量的減少，黃酮和多酚溶解度下降，溶出量減少；另一方面，隨著有機(jī)酸的增加，酚類物質(zhì)與其發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生酚酸類化合物，導(dǎo)致酚類物質(zhì)的下降[24]。第二，陳釀初期微生物產(chǎn)生的酶可將原料細(xì)胞壁上的大分子物質(zhì)分解，隨著原料汁液滲出，有利于酚類物質(zhì)的溶出；其次，多酚類物質(zhì)可以通過疏水鍵和多元?dú)滏I與蛋白質(zhì)結(jié)合，還能與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，這些都能導(dǎo)致酚類物質(zhì)含量的減少。

圖3 松針酵素陳釀期間維生素C、黃酮及多酚含量變化Fig. 3 Changes of vitamin C, flavonoids and polyphenols contents in pine needle enzyme during aging periods

2.1.4 松針酵素陳釀期間金屬元素含量變化

由圖4可知，Ca、Na、Mg和K的含量呈波浪式變化，F(xiàn)e的含量基本保持不變。這主要是因?yàn)殛愥勂陂g，隨著多酚物質(zhì)的增加，與金屬元素會(huì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成沉淀，導(dǎo)致金屬元素含量減少；但隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，松酵酸度的增加，從陶缸中溶出的金屬元素含量會(huì)隨之增加[25]；3～4年松針酵素中金屬元素含量下降的原因可能主要和陶缸的結(jié)構(gòu)有關(guān)。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，陶缸的吸附能力及透氣性能受到影響，發(fā)酵液與陶缸表面的接觸相對(duì)減弱，進(jìn)而影響到松酵中金屬元素的溶入[26]。

圖4 松針酵素陳釀期間金屬元素含量變化Fig. 4 Changes of the metal elements contents in pine needle enzyme during aging periods

2.2 主成分分析

2.2.1 不同陳釀期松針酵素的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量

4個(gè)不同陳釀期松針酵素的主要營(yíng)養(yǎng)成分及其含量見表1，微量元素及其含量見表2。

表1 松針酵素陳釀期松針酵素主要營(yíng)養(yǎng)成分含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of main nutrients contents in pine needle enzyme during aging periods

表2 松針酵素陳釀期松針酵素微量營(yíng)養(yǎng)成分含量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of micronutrients contents in pine needle enzyme during aging periods

2.2.2 松針酵素營(yíng)養(yǎng)成分的主成分分析[27-28]

為了避免原始數(shù)據(jù)對(duì)分析結(jié)果的影響，本研究對(duì)4個(gè)不同陳釀期松針酵素的蛋白質(zhì)、還原糖、總糖、VC、黃酮、多酚、pH、總酸、可溶性固形物、Ca、K、Na、Mg、Fe、維生素B6的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表3 所示。

表3 主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalue, contribution rate and accumulating contribution rate of principal components

由表3可知，前三個(gè)主成分的特征值均＞1，分別為9.363、3.544、2.093。其中各個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為62.420%、23.628%、13.951%，三個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率能反映100%的信息，說明這3個(gè)主成分反映了原始變量的全部信息。因此選取前3個(gè)主成分來評(píng)價(jià)松針酵素的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行最大正交旋轉(zhuǎn)處理，旋轉(zhuǎn)后的主成分載荷矩陣見表4。由表4可知，在第一主成分中，VC有較大的正系數(shù)，說明第一主成分中VC為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中黃酮、多酚含量正向載荷權(quán)數(shù)較高，故第一主成分可歸類于功效成分。第二主成分中金屬元素Na、Mg、Ca載荷權(quán)數(shù)為最高，且有負(fù)向影響，其占比均＞0.95，這表明第二主成分中Na、Mg、Ca含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以把第二主成分歸類于微量元素。在第三主成分方中蛋白質(zhì)有最大的正向載荷權(quán)數(shù)，為0.997，表明第三主成分中蛋白質(zhì)為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，故第三主成分歸類于基礎(chǔ)能量物質(zhì)。

表4 主成分因子旋轉(zhuǎn)載荷矩陣Table 4 Rotation load matrix of principal components

綜上所述，松針酵素的VC、金屬元素Na、Mg、Ca及蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)松針酵素質(zhì)量品質(zhì)的主要指標(biāo)。

2.2.3 松針酵素質(zhì)量品質(zhì)主成分分析得分及綜合評(píng)價(jià)

各指標(biāo)變量的主成分載荷與主成分相對(duì)應(yīng)的特征值相比，再開平方根，即可得到3個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量[29]。以特征向量為權(quán)重構(gòu)建4個(gè)主成分的表達(dá)函數(shù)式：

三個(gè)表達(dá)式中，Z1、Z2、Z3分別表示第一主成分、第二主成分以及第三主成分的得分，X1～X15分別表示pH、VC、蛋白質(zhì)、多酚、黃酮、還原糖、總糖、總酸、可溶性固形物、Ca、K、Na、Mg、Fe及維生素B6。以各個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，由主成分得分和對(duì)應(yīng)的權(quán)重線性加權(quán)求和得到綜合評(píng)價(jià)函數(shù)[30]。松針酵素綜合評(píng)價(jià)函數(shù)：F=0.624 2Z1+0.236 28Z2+0.139 51Z3。

根據(jù)酵素綜合評(píng)價(jià)函數(shù)，計(jì)算出了4個(gè)不同陳釀期松針酵素的綜合得分值（F）和總排名結(jié)果見表5。由表5可知，排名第一位的為2年陳釀期松針酵素。由主成分載荷矩陣分析結(jié)果可知，VC對(duì)第一主成分影響較為顯著（P＜0.05）；2年酵素中的VC、多酚、黃酮含量較高，因而此年份的酵素在第一主成分得分較高。在第二主成分中金屬元素有最大的負(fù)向影響；由于2年酵素VC、多酚和黃酮含量較高，故在4個(gè)陳釀期中排名靠前。

表5 不同陳釀期松針酵素綜合評(píng)價(jià)結(jié)果及排序Table 5 Comprehensive scores results and ranking of pine needle enzyme during different aging periods

3 結(jié)論

松針酵素營(yíng)養(yǎng)豐富，但隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，如：氧化還原、酯化、縮合、聚合反應(yīng)等，會(huì)導(dǎo)致不同營(yíng)養(yǎng)成分的增加與減少。蛋白質(zhì)含量分別以快速、稍平緩和慢速下降的趨勢(shì)減少；還原糖和總糖減少速度較緩慢；多酚、黃酮和VC含量積累到最大值后再緩慢減少，總量分別減少了21.44%、35.72%和0.66%；隨著溶液體系中酸的積累，pH值緩慢下降，總酸含量逐年上升；金屬元素Ca、K、Na、Mg和Fe含量則呈波浪式變化。

采用主成分分析對(duì)松針酵素品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其結(jié)果顯示，前3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率＞85%，說明這3個(gè)主成分反映了原始變量的大部分信息；VC、金屬元素Na、Mg、Ca以及蛋白質(zhì)是評(píng)價(jià)松針酵素品質(zhì)的主要指標(biāo)；2年陳釀期的松針酵素綜合評(píng)分最高，為0.9，說明在此階段各營(yíng)養(yǎng)組分已累積到最大，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高。