響應(yīng)面法優(yōu)化凝固型發(fā)酵椰奶工藝

雷文平，吳詩(shī)敏，李彩虹，周 輝，吳 霓，宋艷菲，劉成國(guó)*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128）

椰子（Cocos nucifera），是一種單子葉被子植物，屬棕櫚科椰子屬，植株高大，具有較高營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值[1]。椰子在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防心血管疾病、促進(jìn)礦物質(zhì)、維生素和氨基酸吸收等方面具有明顯效果[2-3]，如：椰子所富含的維生素E（vitamin E，VE）能保持女性青春活力，鎂可改善老年人的循環(huán)系統(tǒng)[4-5]。目前，各種酸奶的研制主要集中在以牛乳作為主要原料或牛乳與其他物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配、工藝條件優(yōu)化、發(fā)酵菌種等方面[6]，對(duì)主要原料的改進(jìn)與創(chuàng)新方面的研究較少，且僅利用椰漿作為原料發(fā)酵的酸奶仍是空白。

響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是通過(guò)對(duì)回歸方程的分析、優(yōu)化工藝參數(shù)預(yù)測(cè)響應(yīng)值的一種統(tǒng)計(jì)方法，該方法可以反應(yīng)出不同因素之間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的交互影響，彌補(bǔ)了普通正交優(yōu)化法僅考慮單因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響[7-8]。因此，本研究以椰漿作為原料發(fā)酵凝固型椰奶，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得凝固型發(fā)酵椰奶的最佳工藝參數(shù)，并對(duì)產(chǎn)品的感官、理化、微生物指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，為凝固型椰奶的實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佳樂(lè)椰漿：SAMBU集團(tuán)；直投式發(fā)酵劑（directed vat set，DVS）Y428A、Y439B、Y429A：上海昊岳食品科技有限公司；脫脂奶粉：太子奶集團(tuán)生物科技有限責(zé)任公司；果膠（食品級(jí)）：厚滿生物科技（上海）有限公司；海藻酸丙二醇酯（propylene glycol alginate，PGA）（食品級(jí)）：鄭州億之源化工產(chǎn)品有限公司；白砂糖（食品級(jí)）：長(zhǎng)沙尚杰食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-400-S生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；GJJ-0.03/100均質(zhì)機(jī)：上海諾尼輕工機(jī)械有限公司；NDJ-8S數(shù)顯粘度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凝固型發(fā)酵椰奶的制備

操作要點(diǎn)：

調(diào)配：向椰漿中加入果膠、PGA以及白砂糖，然后加水至所需用量，混合攪拌均勻，制備成椰奶，備用。

預(yù)熱與均質(zhì)：椰奶在溫度為60 ℃、壓力為25 MPa的條件下進(jìn)行一級(jí)均質(zhì)處理2～3次[9]。

殺菌與冷卻：將上述椰奶在溫度為95 ℃條件下殺菌25 min，然后冷卻至35 ℃左右，備用[10]。

發(fā)酵劑的制備：配制0.12 g/mL的脫脂牛奶液100 mL，并在95 ℃的條件下滅菌25 min；然后在無(wú)菌條件下，稱(chēng)取0.5 g的直投式發(fā)酵劑，加入到殺菌冷卻后的脫脂牛奶液中，混合并攪拌均勻，放入0～4 ℃的冰箱中冷藏保存，待用。

接種與發(fā)酵：在35 ℃左右的無(wú)菌條件下，將所制備發(fā)酵劑加入到椰奶中，然后在一定溫度條件下發(fā)酵7～12 h，達(dá)到凝固狀態(tài)，酸度為55～65°T時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)。

冷卻與后熟：將恒溫發(fā)酵后的產(chǎn)品迅速冷卻至10 ℃以下，放入0～4 ℃的冰箱冷藏后熟24 h[11]。

1.3.2 凝固型發(fā)酵椰奶工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

按照方法1.3.1的工藝流程制備凝固型發(fā)酵椰奶，以感官評(píng)分、黏度和酸度達(dá)到60°T所需時(shí)間為響應(yīng)指標(biāo)，采用單因素輪換法依次考察椰漿添加量（80%、85%、90%、95%、100%）、直投式發(fā)酵劑類(lèi)型（Y428A、Y439B、Y429A）、發(fā)酵劑添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度（37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃、45 ℃）對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶的影響。發(fā)酵初始條件為發(fā)酵溫度41 ℃、直投式發(fā)酵劑Y439B、發(fā)酵劑用量2%。

1.3.3 凝固型發(fā)酵椰奶工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)感官評(píng)分影響顯著的3個(gè)因素，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化[12]。

1.3.4 凝固型發(fā)酵椰奶質(zhì)量的測(cè)定

在最佳優(yōu)化工藝條件下制備凝固型發(fā)酵椰奶，對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)并測(cè)定其黏度、滴定酸度、持水力及相關(guān)微生物指標(biāo)。

（1）感官評(píng)價(jià)

以色澤、組織狀態(tài)、滋味、氣味為感官評(píng)價(jià)指標(biāo)。邀請(qǐng)10名經(jīng)過(guò)感官評(píng)價(jià)訓(xùn)練的人進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿分為100分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13-14]見(jiàn)表1。

表1 凝固型發(fā)酵椰奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of set-style fermented coconut milk

（2）理化指標(biāo)

黏度：樣品發(fā)酵8 h并后熟24 h之后立即用NDJ-8S數(shù)顯粘度計(jì)在室溫條件下，采用3號(hào)轉(zhuǎn)子，固定轉(zhuǎn)速12 r/min測(cè)定其粘度。酸度達(dá)到60°T所需時(shí)間：樣品發(fā)酵4 h后，開(kāi)始每隔0.5 h測(cè)定其酸度，直至酸度達(dá)到（60±1）°T為止，記錄其時(shí)間；其中酸度的測(cè)定根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》測(cè)定[15]。持水力：樣品發(fā)酵8 h并后熟24 h之后，稱(chēng)取5 g樣品，4 000 r/min條件下離心10 min，靜置10 min，除去透明液體，測(cè)殘余物的質(zhì)量，計(jì)算持水力，其計(jì)算公式如下：

式中：m代表殘余物的質(zhì)量，g；m0代表樣品的質(zhì)量，g。（3）微生物指標(biāo)的測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定其菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)和嗜熱鏈球菌數(shù)[16]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Design-Expert V8.0.5進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析；采用OriginPro8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 椰漿添加量對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著椰漿添加量的增加，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分先升高后降低，而發(fā)酵椰奶的黏度則先增加后趨向穩(wěn)定。當(dāng)椰漿添加量為95%時(shí)，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分最高（83.6分），此時(shí)黏度趨于穩(wěn)定（5 800 mPa·s），同時(shí)，酸度到達(dá)60°T所需時(shí)間相對(duì)較短（7 h）。分析原因可能是椰漿濃度越高，椰子固有風(fēng)味隨之增加，但過(guò)高反而掩蓋了發(fā)酵特有風(fēng)味；而且椰漿的添加量決定著發(fā)酵椰奶的黏度，椰漿濃度越低黏度也越低。綜上所述，選擇最優(yōu)椰漿用量為95%。

圖1 椰漿添加量對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of coconut milk addition on the quality of set-style fermented coconut milk

2.1.2 直投式發(fā)酵劑類(lèi)型對(duì)發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響

由圖2可知，不同類(lèi)型的直投式發(fā)酵劑對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶的感官品質(zhì)影響較?。≒＞0.05），而對(duì)發(fā)酵椰奶的黏度影響較大（P＜0.05）。當(dāng)直投式發(fā)酵劑的型號(hào)為Y429A時(shí)，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分最高（82分），黏度也相對(duì)較高（5 975 mPa·s），酸度到達(dá)60°T所需時(shí)間最短（7 h）；而當(dāng)直投式發(fā)酵劑類(lèi)型為Y439B時(shí)，雖然黏度最高（6 030 mPa·s）、酸度到達(dá)60°T所需時(shí)間相對(duì)較短（7.5 h），但感官得分最低（78.7分），所以選擇最佳直投式發(fā)酵劑的型號(hào)為Y429A。

圖2 直投式發(fā)酵劑類(lèi)型對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of the types of DVS on the quality of set-style fermented coconut milk

2.1.3 發(fā)酵劑添加量對(duì)發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響

由圖3可知，發(fā)酵劑添加量對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶的感官品質(zhì)影響顯著（P＜0.05），而對(duì)發(fā)酵椰奶的黏度影響較?。≒＞0.05）。當(dāng)發(fā)酵劑添加量為3%時(shí)，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分達(dá)到最高（84.8分），此時(shí)酸度到達(dá)60°T所需時(shí)間也相對(duì)較短（7 h）。分析原因可能是發(fā)酵劑添加量較低時(shí)，相同溫度下發(fā)酵速度相對(duì)較慢，特有風(fēng)味還未產(chǎn)生；而當(dāng)發(fā)酵劑添加量過(guò)高時(shí)，產(chǎn)酸速度過(guò)快，相同時(shí)間內(nèi)使得凝固型發(fā)酵椰奶過(guò)酸，影響其滋味。綜合分析，當(dāng)發(fā)酵劑添加量為3%時(shí)，發(fā)酵椰奶酸甜可口，組織狀態(tài)穩(wěn)定，此時(shí)效果最佳，因此，選擇最佳發(fā)酵劑添加量為3%。

圖3 發(fā)酵劑添加量對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of starter addition on the quality of set-style fermented coconut milk

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響

由圖4可知，發(fā)酵溫度對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶的感官品質(zhì)和黏度都有顯著影響（P＜0.05）。當(dāng)發(fā)酵溫度為39 ℃時(shí)，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分（90分）和黏度（7 185 mPa·s）最高，且酸度達(dá)到60°T的所需時(shí)間相對(duì)較短（7 h）。分析原因可能是溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，從而影響其發(fā)酵性能，使得產(chǎn)酸能力下降。綜合分析，最優(yōu)發(fā)酵溫度為39 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on the quality of set-style fermented coconut milk

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)[17-18]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用直投式發(fā)酵劑Y429A，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，以對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶影響顯著的3個(gè)因素椰漿添加量（X1）、發(fā)酵劑添加量（X2）和發(fā)酵溫度（X3）為考察因素，Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3。

表2 凝固型發(fā)酵椰奶發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of set-style fermented coconut milk

表3 凝固型發(fā)酵椰奶發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments fermentation conditions optimization of set-style fermented coconut milk

運(yùn)用Design expert V8.0.5軟件對(duì)表3中得分進(jìn)行擬合，得回歸方程：

對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果表見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments results

由表4可知，所建立模型的P＜0.000 1，顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，表明模型具有較高可靠性；調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.979 0，表明凝固型發(fā)酵椰奶感官得分的變化有97.90%來(lái)源于椰漿添加量、發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵溫度；信噪比（signal-to-noise，S/N）=22.53＞4，也從另一個(gè)方面表明此模型是可靠的。經(jīng)方差分析，3個(gè)因素對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶影響的主次順序?yàn)閄1＞X3＞X2，即椰漿添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵劑添加量。其中，一次項(xiàng)X1和X3對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），X2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；交互項(xiàng)X1X2和X2X3對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），X1X3對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)X12、X22和X32對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面分析[19-20]

椰漿添加量、發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵溫度交互作用對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)面曲線及等高線見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶感官品質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on sensory quality of set-style fermented coconut milk

由圖5可知，當(dāng)固定發(fā)酵溫度時(shí)，隨著椰漿添加量和發(fā)酵劑添加量的增大，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分都是呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，椰漿添加量在93.90%～97.10%和發(fā)酵劑添加量在2.70%～3.40%的范圍內(nèi)較適合；等高線呈閉合的橢圓形且響應(yīng)面呈凸形，表明椰漿添加量和發(fā)酵劑添加量交互作用較強(qiáng)且有最大值。當(dāng)固定發(fā)酵劑添加量時(shí)，隨著椰漿添加量和發(fā)酵溫度的增大，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分都是呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，椰漿添加量在93.90%～97.10%和發(fā)酵溫度在38.50～39.60 ℃的范圍內(nèi)較適合；響應(yīng)面呈凸形，表明椰漿添加量和發(fā)酵溫度交互作用有最大值。當(dāng)固定椰漿添加量時(shí)，隨著發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵溫度的增大，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分都是呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵劑添加量在2.70%～3.40%，發(fā)酵溫度在38.50～39.60 ℃的范圍內(nèi)較適合；等高線呈閉合的橢圓形且響應(yīng)面呈凸形，說(shuō)明發(fā)酵劑用量和發(fā)酵溫度交互作用較強(qiáng)且有最大值。上述分析和表4中的顯著性一致。

利用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)所得的回歸方程進(jìn)行逐步回歸，確定最佳工藝參數(shù)為椰漿添加量95.52%、發(fā)酵劑添加量3.08%、發(fā)酵溫度39.19 ℃，此時(shí)凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分預(yù)測(cè)值為86.16分。為了便于實(shí)際操作，將最佳工藝參數(shù)修訂為椰漿添加量95%、發(fā)酵劑添加量3%、發(fā)酵溫度39 ℃，在此最優(yōu)條件下，凝固型發(fā)酵椰奶的感官得分為85.3分，與模型預(yù)測(cè)值（86.16分）較一致，驗(yàn)證了模型的可靠性。

2.3 凝固型發(fā)酵椰奶質(zhì)量分析

感官指標(biāo)：在最佳工藝條件下所得凝固型發(fā)酵椰奶為純白色，色澤均一，口感細(xì)膩柔和、酸甜適中，具有椰子和發(fā)酵乳融合的特有風(fēng)味，質(zhì)地穩(wěn)定均一、無(wú)雜質(zhì)及分層，表面光滑。

理化指標(biāo)：黏度為6 720 mPa·s，滴定酸度為62.1°T，持水力為62.53%。

微生物指標(biāo)：菌落總數(shù)為5.55×105CFU/g，乳酸菌數(shù)為5×105CFU/g，嗜熱鏈球菌數(shù)為3×104CFU/g，微生物指標(biāo)符合相關(guān)國(guó)標(biāo)要求。

3 結(jié)論

本研究以椰漿作為原料，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法確定凝固型發(fā)酵椰漿的最佳工藝參數(shù)：椰漿添加量95%、發(fā)酵劑類(lèi)型Y429A、發(fā)酵劑添加量3%、發(fā)酵溫度39 ℃。在此最優(yōu)條件下制備的凝固型發(fā)酵椰奶感官得分為85.3分，所得產(chǎn)品為純白色，色澤均一，口感細(xì)膩柔和、酸甜適中，具有椰子和發(fā)酵乳融合的特有風(fēng)味，質(zhì)地穩(wěn)定均一、無(wú)雜質(zhì)及分層，表面光滑。黏度為6 720 mPa·s，滴定酸度為62.1°T，持水力為62.53%，微生物指標(biāo)符合相關(guān)國(guó)標(biāo)要求。為發(fā)酵椰奶的實(shí)際生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。