乳酸菌Ⅱ類細(xì)菌素生物合成及其代謝調(diào)控策略

章檢明，張?zhí)m威，，易華西，韓 雪*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150000；2.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266000）

乳酸菌（lactic acid bacteria）細(xì)菌素（bacteriocins）是乳酸菌經(jīng)由核糖體合成和翻譯后修飾而成的一類具有抑制細(xì)菌作用的多肽或蛋白類物質(zhì)（antimicrobial peptides）[1]。根據(jù)細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性、抑菌譜、胰蛋白酶敏感性和抑菌機(jī)理等特性可將其分為羊毛硫抗生素類（classⅠ）如乳酸鏈球菌素（Nisin），不含羊毛硫氨酸的多肽類（classⅡ），熱敏感的大分子蛋白（＞30 kDa）（Class Ⅲ）和復(fù)合型細(xì)菌素（class Ⅳ）四類[1]。目前，乳酸菌細(xì)菌素唯一實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的是Ⅰ類羊毛硫抗生素類中的Nisin，并廣泛應(yīng)用于食品防腐。而Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素相比于Ⅰ類、Ⅲ類和Ⅳ類細(xì)菌素具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和抑菌活性以及更廣的抑菌譜，比如對(duì)單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）具有強(qiáng)烈的抑制作用，故對(duì)其挖掘和研究已成為當(dāng)今細(xì)菌素領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2]。但是到目前為止Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素的產(chǎn)量較低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，因此其生物合成產(chǎn)量是目前的研究重點(diǎn)。

對(duì)微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控是提高代謝產(chǎn)物合成量的重要策略，如切斷產(chǎn)物副反應(yīng)途徑；優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件；增強(qiáng)關(guān)鍵酶的活性等。通過(guò)這些策略，許多微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量得到了大幅度的提高[3-5]。目前，在提高乳酸菌Ⅱ類細(xì)菌素產(chǎn)量策略方面，絕大多數(shù)研究是通過(guò)篩選最優(yōu)碳源、氮源成分；優(yōu)化培養(yǎng)條件等方法。近些年來(lái)隨著對(duì)細(xì)菌素合成和降解代謝研究逐漸深入，尤其是對(duì)Ⅱ類細(xì)菌素生物合成基因簇的研究有了突破性的進(jìn)展，例如目前已經(jīng)克隆得到了植物乳桿菌細(xì)菌素生物合成基因簇的絕大部分基因，并且大部分基因的功能也得到了驗(yàn)證[6-7]，這使得通過(guò)改造Ⅱ類細(xì)菌素的合成代謝及降解途徑來(lái)提高細(xì)菌素產(chǎn)量成為可能。本文主要綜述了目前Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素生物合成和降解途徑，并從代謝調(diào)控角度提出提高Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)量的可行性策略，為提高Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)量提供一個(gè)全新、重要的途徑，也為Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 Ⅱ類細(xì)菌素分類及其特性

乳酸菌Ⅱ類細(xì)菌素是一類由核糖體合成的，分子質(zhì)量＜10 kDa，具有熱穩(wěn)定性的多肽類物質(zhì)。COTTER P D等[8]根據(jù)Ⅱ類細(xì)菌素性質(zhì)，將其分為四類：Ⅱa類片球菌素、Ⅱb兩肽細(xì)菌素、Ⅱc環(huán)狀細(xì)菌素和Ⅱd非片球菌素線性多肽（見(jiàn)表1），這一分類也被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可。

表1 乳酸菌Ⅱ類細(xì)菌素分類Table 1 Classification of class II bacteriocins of lactic acid bacteria

1.1 Ⅱa類細(xì)菌素

Ⅱa細(xì)菌素是由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生的肽類物質(zhì)。近年來(lái)，由于其能有效的抑制單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）等食品腐敗或致病菌而備受關(guān)注，被認(rèn)為是一種具有巨大潛力的天然食品防腐劑。它由37～55個(gè)氨基酸組成，在N末端含有Y-G-N-G-V-X1-C-X2-K/N-X3-X4-C（Y為酪氨酸；G為甘氨酸；N為天冬酰胺；V為纈氨酸；X為任意氨基酸；C為半胱氨酸；K為懶氨酸）保守氨基酸殘基，被稱為“片球菌素序列框區(qū)域（pediocin box）”。在Ⅱa類細(xì)菌素的N末端還含有一個(gè)由兩個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵。同時(shí)，Ⅱa類細(xì)菌素除了在運(yùn)輸過(guò)程中將引導(dǎo)序列切除外，不在進(jìn)行任何修飾。C末端是一個(gè)疏水或兩親的區(qū)域，與N末端相比具有較差的保守型。JOHNSEN L等[9]研究發(fā)現(xiàn)，C末端與特異性結(jié)合目標(biāo)菌有關(guān)，而N末端的“片球菌素序列框區(qū)域”則與非特異性結(jié)合細(xì)胞膜有關(guān)。目前，Sakacin P、Carnobacteriocin B2、Curvacin A等Ⅱa類細(xì)菌素的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，并且三維結(jié)構(gòu)的變化被認(rèn)為是不同Ⅱa細(xì)菌素特異性的基礎(chǔ)[10-12]。此外，少數(shù)Ⅱa類細(xì)菌素（Pediocin PA-1、Enterocin A和Sakacin G）在C末端還含有第二個(gè)二硫鍵，這個(gè)二硫鍵賦予這些細(xì)菌素更廣的抑菌譜和耐熱性[13-14]。因?yàn)樵诟邷貤l件下，含有一個(gè)二硫鍵細(xì)菌素的α-螺旋（位于C末端，與抗菌活性相關(guān)）會(huì)瓦解，但C末端的第二個(gè)二硫鍵能夠維持α-螺旋的穩(wěn)定性。

由于Ⅱa類細(xì)菌素具有廣譜、高效等特點(diǎn)，已成為繼Nisin之后最具開(kāi)發(fā)潛力的天然食品防腐劑。在歐美國(guó)家，Pediocin PA-1已經(jīng)在肉制品和奶酪制品中得到應(yīng)用。因此，將Ⅱa類細(xì)菌素與其他防腐技術(shù)相結(jié)合構(gòu)成多重防腐系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)防御效果并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，以及提高合成量來(lái)滿足工業(yè)化需求將成為未來(lái)研究的重點(diǎn)。

1.2 Ⅱb類細(xì)菌素

Ⅱb類細(xì)菌素是由兩條肽鏈組成的雙肽細(xì)菌素，最初是在乳酸菌的代謝產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)，兩條肽鏈各自的氨基酸殘基數(shù)目一般＜40，如Plantaricin S分別由26/24個(gè)氨基酸殘基組成[15]。但是，也有一些Ⅱb類細(xì)菌素至少含有一條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)＞50，如Brochocin C[16]。這兩條肽鏈只有相互結(jié)合成復(fù)合體后才具有強(qiáng)烈的抑菌活性，單獨(dú)一條肽鏈無(wú)活性或活性很低。目前，Lactococcin G、Plantaricin EF、Plantaricin JK等Ⅱb類細(xì)菌素的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明，Ⅱb類細(xì)菌素的兩條肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)保守序列GxxxG相互作用而結(jié)合在一起，并且GxxxG序列與抑菌活性密切相關(guān)[17-19]。ROGNE P等[19]將Plantaricin JF中GxxxG序列的甘氨酸殘基替換成其他氨基酸后，發(fā)現(xiàn)Plantaricin JK的活性大幅度降低，認(rèn)為這是由于GxxxG中甘氨酸殘基的替換導(dǎo)致兩條肽鏈的結(jié)合被中斷，致使抑菌活性降低。

目前對(duì)雙肽細(xì)菌素的應(yīng)用研究已有較多報(bào)道，如Lacticin 3147在干酪的應(yīng)用[20]；Lactocin 705在碎牛肉中的應(yīng)用等[21]。但是到目前為止，并沒(méi)有商業(yè)化產(chǎn)品的出現(xiàn)，主要原因還是產(chǎn)量較低。因此，對(duì)提高雙肽細(xì)菌素產(chǎn)量及抑菌能力的研究將是現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。

1.3 Ⅱc類細(xì)菌素

Ⅱc類細(xì)菌素是具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶水解性以及抗李斯特菌性質(zhì)的環(huán)狀細(xì)菌素，因此其不同于由酶合成的環(huán)狀抗菌肽，如短桿菌肽、抗霉枯草菌素等。Ⅱc類細(xì)菌素需要通過(guò)翻譯后修飾才能形成成熟的細(xì)菌素，通常是由N末端和C末端通過(guò)共價(jià)連接后形成環(huán)狀骨架。目前，運(yùn)用核磁共振、X射線衍射等方法已經(jīng)得到了Carnocyclin A和EnterocinAS-48這兩個(gè)環(huán)狀細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)。研究顯示Ⅱc類細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)中存在著有序重復(fù)的α-螺旋[22-23]。目前有8個(gè)Ⅱc類細(xì)菌素已經(jīng)被鑒定，其中6個(gè)來(lái)源于乳酸菌（Gassericin A、Reutericin 6、Enterocin AS-48、Enterocin 4、Carnocyclin A 和Lactocyclicin Q），另外兩個(gè)為Cirularin A（來(lái)源于拜氏梭菌）和Butyrivibriocin AR（來(lái)源于溶纖維丁酸弧菌）[1]。有研究人員將這8個(gè)細(xì)菌素的氨基酸序了進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，N末端區(qū)域具有較高的相似性，預(yù)測(cè)這一區(qū)域可能含有兩個(gè)不同的螺旋結(jié)構(gòu)。

Ⅱc類細(xì)菌素獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，賦予了其良好的抗菌特性，成為繼Ⅱa類細(xì)菌素之后又一個(gè)具有應(yīng)用潛力的細(xì)菌素。因此未來(lái)應(yīng)該深入研究其抗菌特性、抑菌機(jī)理及提高生物合成量，為日后工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1.4 Ⅱd類細(xì)菌素

根據(jù)COTTER P D的分類，將非片球菌素線性多肽歸類為Ⅱd類細(xì)菌素，但是這一類型細(xì)菌素序列沒(méi)有明顯的相似性。因此，一些研究人員將Ⅱ類細(xì)菌素只分為三個(gè)亞類（Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc），并不含有Ⅱd這一亞類[24]。不過(guò)，NISSENMEYER J等[25]保留了Ⅱd這一亞類，將31種細(xì)菌素歸類入Ⅱd類細(xì)菌素，其中29種來(lái)源于乳酸菌，2種源于金黃色葡萄球菌（見(jiàn)表2）。對(duì)于Ⅱd類細(xì)菌素的歸類目前沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此進(jìn)一步研究Ⅱd類細(xì)菌素在核酸序列、氨基酸序列以及抑菌機(jī)理上是否存在著相似性，可為這一亞類的存在提供理論依據(jù)。

表2 Ⅱd類乳酸菌細(xì)菌素的微生物來(lái)源Table 2 Microorganisms sources of class Ⅱd bacteriocins of lactic acid bacteria

2 乳酸菌Ⅱ類細(xì)菌素生物合成及降解途徑

乳酸菌細(xì)菌素是核糖體合成的一類肽類代謝產(chǎn)物。因此，它的合成首先是在核糖體上進(jìn)行的，隨后通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行加工和運(yùn)輸，最后才形成具有活性的細(xì)菌素。而乳酸菌細(xì)菌素的降解則是由乳酸菌蛋白酶系統(tǒng)完成的，可能被水解成氨基酸，用于細(xì)菌自身利用，這將導(dǎo)致細(xì)菌素不能得到有效積累。

2.1 生物合成途徑

通常來(lái)說(shuō)，Ⅱ類細(xì)菌素的合成首先需在特定環(huán)境因素刺激下，比如信號(hào)分子濃度需達(dá)到一定閾值時(shí)，細(xì)菌素基因才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。與此同時(shí)，組成細(xì)菌素的氨基酸在氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶的參與下共價(jià)地與轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）形成氨酰-tRNA，之后氨酰-tRNA結(jié)合到信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）（含有細(xì)菌素合成的遺傳密碼，用于指導(dǎo)特定細(xì)菌素氨基酸序列的合成）的特殊位點(diǎn)上，核糖體結(jié)合到mRNA分子合成起始序列上，并由此開(kāi)始讀碼，沿著密碼序列合成前體肽。但這個(gè)前體肽不具備生物活性，需要進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)運(yùn)后才能形成成熟的細(xì)菌素。首先腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABCT）的蛋白水解區(qū)域結(jié)合前體肽的引導(dǎo)序列，觸發(fā)三磷酸腺苷（ATP）水解，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致引導(dǎo)序列被切除，同時(shí)在輔助蛋白的協(xié)助下，成熟的細(xì)菌素被運(yùn)送至胞外（見(jiàn)圖1）[26]。

圖1 乳酸菌Ⅱ類細(xì)菌素生物合成及降解途徑Fig. 1 Biosynthesis and degradation pathways of class Ⅱbacteriocins of lactic acid bacteria

前體肽的引導(dǎo)序列由18～27個(gè)氨基酸殘基組成，被認(rèn)為是細(xì)菌素加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)肽，并且含有一個(gè)保守的雙甘氨酸殘基，這些雙甘氨酸殘基可能作為轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的識(shí)別信號(hào)。前體肽作為細(xì)菌素的前體物質(zhì)，它的合成影響著細(xì)菌素的產(chǎn)量。因此，增加前體肽的合成量是提高細(xì)菌素產(chǎn)量一個(gè)重要策略。但是，前體肽在胞內(nèi)大量積累會(huì)對(duì)細(xì)菌素的合成產(chǎn)生反饋抑制，雖然目前還沒(méi)有明確的報(bào)道證明這種反饋抑制的存在，不過(guò)從其他一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成過(guò)程推測(cè)（例如阿維菌素的合成受到胞內(nèi)反饋抑制的影響[27]），這種反饋抑制應(yīng)該存在于細(xì)菌素的合成過(guò)程。所以，在增加前體肽合成量后，將前體肽及時(shí)進(jìn)行加工及運(yùn)送至胞外是提高成熟細(xì)菌素產(chǎn)量的必要條件。

典型的Ⅱ類細(xì)菌素ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有715～724個(gè)氨基酸，并且在N端和C端具有高度的同源性，也是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮活性的關(guān)鍵部位[28]。C端含有200個(gè)末端氨基酸殘基組成的保守ATP結(jié)合區(qū)域；N端是一個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中外延的150個(gè)氨基酸負(fù)責(zé)切割引導(dǎo)序列。VENEMA K等[29]對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的N端進(jìn)行了功能研究證實(shí)了這一功能，認(rèn)為N末端只參與切割，不參與轉(zhuǎn)運(yùn)。HAVARSTEIN L S等[30]認(rèn)為，細(xì)菌素的切割和轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)整體的加工過(guò)程，引導(dǎo)序列是進(jìn)行切割和釋放的一個(gè)識(shí)別信號(hào)。輔助蛋白含有460個(gè)氨基酸，也具有高度的同源性，C端是一個(gè)親水域，N端是個(gè)跨膜的疏水域，推測(cè)它具有輔助細(xì)菌素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或加工前體肽的作用。PAL G等[31]在體外研究輔助蛋白功能時(shí)發(fā)現(xiàn)輔助蛋白并不參與前體肽切割，可能對(duì)成熟細(xì)菌素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有作用。不過(guò)，輔助蛋白具體發(fā)揮何種功能目前還不是十分清楚。

2.2 降解途徑

乳酸菌細(xì)菌素的降解是由乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)參與完成，這個(gè)蛋白水解系統(tǒng)分三個(gè)步驟對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行降解[32]。首先，胞外的細(xì)菌素在蛋白水解酶的作用下被水解成小肽（如寡肽、二肽、三肽等）；之后，這些小肽通過(guò)多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)；最后，在胞內(nèi)肽酶的作用下，小肽可能被水解成氨基酸，被菌體自身利用（見(jiàn)圖1）。

目前，一些乳酸菌的蛋白水解酶基因已經(jīng)被克隆和鑒定出來(lái)，包括乳酸乳球菌和副干酪乳桿菌的蛋白水解酶PrtP，瑞士乳桿菌的蛋白水解酶PrtH，鼠李糖乳桿菌的蛋白水解酶PrtR，嗜熱鏈球菌的蛋白水解酶PrtS以及保加利亞乳桿菌的蛋白水解酶PrtB[32]。并且，一些乳酸菌可能還含有兩種以上的蛋白水解酶，這些蛋白水解酶是細(xì)菌素降解過(guò)程中最為關(guān)鍵的酶。如果能使這些蛋白水解酶活性或表達(dá)量降低，可使細(xì)菌素在胞外大量積累。但是，目前對(duì)蛋白水解酶調(diào)控細(xì)菌素活性的研究報(bào)道很少，也不清楚細(xì)菌素被蛋白酶降解后的片段大小。因此，這些片段具體是通過(guò)哪個(gè)多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入胞內(nèi)，以及這些片段在胞內(nèi)是否被內(nèi)肽酶降解成氨基酸，還是發(fā)揮其他特殊功能還需要深入研究。

3 代謝調(diào)控增加Ⅱ類細(xì)菌素產(chǎn)量的策略

一般而言，代謝調(diào)控增加Ⅱ類細(xì)菌素產(chǎn)量的策略可以從以下幾個(gè)方面入手：增加底物濃度，提高前體物的供應(yīng)；改造轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，解除細(xì)菌素胞內(nèi)抑制；切斷細(xì)菌素降解途徑，加強(qiáng)細(xì)菌素胞外積累。

3.1 增加底物濃度，提高前體物的供應(yīng)

細(xì)菌素是由核糖體合成的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，因此氨基酸可作為細(xì)菌素的底物，增加其供應(yīng)量可以促進(jìn)細(xì)菌素前體物的積累。VUYST L[33]研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中加入適量的絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸能使Nisin的產(chǎn)量提高2倍，認(rèn)為這三種氨基酸作為底物直接參與Nisin的合成，從而提高Nisin的產(chǎn)量。并且，半胱氨酸相比其他的氨基酸促進(jìn)效果更佳明顯，原因可能是細(xì)菌自身對(duì)于胱氨酸合成比絲氨酸和蘇氨酸更加復(fù)雜。但是VAZQUEAZ J A等[34]研究發(fā)現(xiàn)，只有半胱氨酸和色氨酸能夠刺激Nisin的合成，這與VUYST L[33]的結(jié)果不一致，原因可能是氨基酸并不僅僅只作為細(xì)菌素的底物發(fā)揮作用，還可能發(fā)揮著其他一些功能[35]。如對(duì)細(xì)菌素合成、釋放及調(diào)控過(guò)程中相關(guān)酶的誘導(dǎo)。盡管目前沒(méi)有明確的報(bào)道證明氨基酸能夠誘導(dǎo)細(xì)菌素合成過(guò)程中相關(guān)酶的活性，但從氨基酸對(duì)其他微生物代謝產(chǎn)物合成的影響猜測(cè)（如甲硫氨酸通過(guò)誘導(dǎo)頭孢菌素C生物合成過(guò)程中異青霉素N合成酶、脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶等而產(chǎn)生刺激作用；色氨酸在麥角生物堿合成中作為底物和誘導(dǎo)物而起作用；亮氨酸在桿菌肽合成過(guò)程中起著誘導(dǎo)作用[36-37]），某些氨基酸能夠通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)酶的活性而對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)量產(chǎn)生影響。猜測(cè)氨基酸可能對(duì)細(xì)菌素加工和釋放過(guò)程中ABCT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助蛋白，以及細(xì)菌素的調(diào)控蛋白（信號(hào)肽、組氨酸蛋白激酶、響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白）具有誘導(dǎo)作用，因?yàn)檫@些蛋白或酶都是細(xì)菌素形成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白或酶，它們活性增強(qiáng)都能夠促進(jìn)細(xì)菌素的合成。

目前，雖然氨基酸的添加有利于細(xì)菌素的合成已經(jīng)得到證實(shí)，不過(guò)一般認(rèn)為氨基酸只作為底物而起到促進(jìn)作用。但是研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸所起的作用并不是單純的作為底物，還可能具有誘導(dǎo)關(guān)鍵酶的作用，并且這一作用可能超出它作為細(xì)菌素合成底物的單一作用。

3.2 改造轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，解除胞內(nèi)反饋抑制

由核糖體合成的前體肽需要經(jīng)過(guò)一系列加工和釋放才能形成具有活性的細(xì)菌素，這一過(guò)程需要ABCT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和一個(gè)輔助蛋白參與。研究表明，將這兩個(gè)蛋白的基因敲出后，突變菌株完全失去了細(xì)菌素合成的能力，說(shuō)明這兩個(gè)蛋白對(duì)細(xì)菌素的合成具有重要的影響。此外，研究報(bào)道指出，微生物的代謝產(chǎn)物如果在胞內(nèi)積累就會(huì)形成反饋抑制，降低該產(chǎn)物的合成。因此，能夠及時(shí)的將胞內(nèi)的產(chǎn)物運(yùn)送出胞外，可以解除胞內(nèi)的反饋抑制，提高產(chǎn)物的合成水平。目前，通過(guò)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)提高對(duì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，增加代謝產(chǎn)物的合成量已有很多成功的案例。如QIU J等[27]將ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AvtAB過(guò)表達(dá)，結(jié)果使阿維霉素的產(chǎn)量提高了兩倍；LI M等[38]過(guò)表達(dá)麥芽糖運(yùn)輸型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后，依維霉素和阿維霉素的產(chǎn)量也分別提高。但是很少研究涉及通過(guò)改造細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)提高細(xì)菌素產(chǎn)量的報(bào)道。相信通過(guò)增加ABCT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助蛋白基因拷貝數(shù)，從而增加轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)量，解除細(xì)菌素胞內(nèi)反饋抑制，是增加細(xì)菌素產(chǎn)量的一個(gè)重要策略。

過(guò)表達(dá)技術(shù)一般分為三個(gè)步驟：①目的基因的克隆與提?。虎诤康幕蜻^(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化；③過(guò)表達(dá)產(chǎn)物的驗(yàn)證。現(xiàn)今，絕大部分乳酸菌細(xì)菌素的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助蛋白基因已經(jīng)被鑒定和克隆出來(lái)，而且具有很高的同源性，并且也有很多技術(shù)成熟的乳酸菌表達(dá)載體的出現(xiàn)。因此，利用過(guò)表達(dá)乳酸菌細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的來(lái)提高細(xì)菌素產(chǎn)量的策略在理論和實(shí)際造作上都是可行的，這一策略也為提高Ⅱ類細(xì)菌素產(chǎn)量的研究提供新的思路。

3.3 切斷降解途徑，加強(qiáng)產(chǎn)物胞外積累

研究顯示，當(dāng)乳酸菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期后期的時(shí)候，細(xì)菌素的活性會(huì)大幅度降低[39]。原因可能是由于在穩(wěn)定期后期，環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，不足以滿足自身需求，因此需要水解環(huán)境中的肽類物質(zhì)（如細(xì)菌素）為自身提供所需的氨基酸。這就需要乳酸菌蛋白酶系統(tǒng)的參與。而蛋白酶水解系統(tǒng)中的蛋白水解酶則是水解細(xì)菌素的關(guān)鍵酶，也對(duì)細(xì)菌素活性的調(diào)控有著重要的作用。VUKOTIC G 等[40]研究了蛋白酶PrtP對(duì)乳球菌素LcnB活性的影響，發(fā)現(xiàn)敲出PrtP基因的菌株，細(xì)菌素的產(chǎn)量得到了很大的提高，這說(shuō)明蛋白酶對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)量確實(shí)能起到調(diào)控作用。因此，可以利用基因敲除技術(shù)或添加蛋白酶抑制劑來(lái)敲除或降低蛋白酶的活性，從而切斷細(xì)菌素的降解途徑，提高細(xì)菌素在胞外的積累。但是，蛋白酶將細(xì)菌素水解成小肽后，是否進(jìn)一步將其水解成氨基酸供自身利用還是發(fā)揮其他功能就不得而知。有一種可能是當(dāng)細(xì)菌素在胞外大量積累時(shí)，由于細(xì)菌素自身不能通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，因此由胞外蛋白酶將其水解成小片段后運(yùn)送至胞內(nèi)，然后這些小肽作為反饋信號(hào)，抑制細(xì)菌素合成中某些關(guān)鍵酶的活性，從而導(dǎo)致細(xì)菌素停止合成，起到反饋抑制作用。

目前，對(duì)細(xì)菌素降解途徑的研究報(bào)道較少，尤其是細(xì)菌素降解對(duì)細(xì)菌素合成調(diào)控的研究更加缺乏。但是，細(xì)菌素的水解產(chǎn)物不僅僅只作為細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用，還可能作為反饋抑制的信號(hào)分子調(diào)控細(xì)菌素的合成。因此，研究細(xì)菌素的降解途徑，尤其是胞外蛋白酶對(duì)細(xì)菌素合成調(diào)控研究為提高細(xì)菌素產(chǎn)量提供一個(gè)新的策略和方向。

4 總結(jié)

乳酸菌Ⅱ類細(xì)菌素產(chǎn)量低，一直是限制其工業(yè)化生產(chǎn)的障礙之一。很多研究通過(guò)對(duì)碳源、氮源等代謝進(jìn)行調(diào)控來(lái)提高細(xì)菌素產(chǎn)量，但是提高幅度有限，仍不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。而利用異源表達(dá)技術(shù)來(lái)提高產(chǎn)量存在安全隱患，并且表達(dá)產(chǎn)物活性普遍較低。近些年對(duì)Ⅱ類細(xì)菌素生物合成和降解過(guò)程的深入研究，特別是對(duì)Ⅱ類細(xì)菌素基因簇研究的日益完善，使之從Ⅱ類細(xì)菌素合成和降解途徑入手，通過(guò)改造細(xì)菌素生物合成及降解途徑來(lái)提高產(chǎn)量成為可能。通過(guò)增加底物濃度，提高前體物供應(yīng)；改造轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，解除胞內(nèi)反饋抑制；切斷降解途徑，增加產(chǎn)物胞外積累等方法來(lái)增加Ⅱ類細(xì)菌素的產(chǎn)量。這些策略將為提高Ⅱ類細(xì)菌素產(chǎn)量提供新的途徑和思路，也為Ⅱ類細(xì)菌素工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。