C1ORF54在小鼠心肌梗死后心臟修復(fù)中的作用

缺血性心臟病是威脅人類健康的主要疾病之一。急性心肌梗死后心肌組織大量損傷、壞死[1]，由于成年哺乳動(dòng)物的心肌再生能力有限，壞死心肌常由肉芽組織和膠原瘢痕替代，引起心室結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致心力衰竭[2-4]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的前體細(xì)胞群可以分泌一系列細(xì)胞因子、趨化因子以及生長因子，并通過旁分泌作用促進(jìn)組織修復(fù)[5]。1號(hào)染色體開放讀碼框54位基因編碼蛋白(C1ORF54)是一種具有潛在促修復(fù)功能的分泌蛋白[6]，本研究旨在探討C1ORF54對(duì)心肌梗死后心臟修復(fù)的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠購買自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，C1ORF54敲除小鼠(C57BL/6遺傳背景，C1KO)購自上海南方模式生物科技股份有限公司。小鼠在上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中以普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間，保持動(dòng)物房內(nèi)適宜的溫度、濕度以及光照時(shí)間，小鼠自由進(jìn)食，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

選取8～12周雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組：敲除假手術(shù)組(n=12)、野生假手術(shù)組(n=12)、敲除心肌梗死模型組(n=17)和野生心肌梗死模型組(n=17)。其中，野生型小鼠處理流程見圖1，C1ORF54敲除小鼠做相同分組處理。

1.3 主要試劑

C1ORF54一抗購自Abnova和Santa Cruz公司；Ki-67、p38絲裂原活化蛋白激酶/磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38/p-P38)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3/磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3/p-STAT3)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和蛋白激酶B/磷酸化蛋白激酶B(AKT/p-AKT)抗體購自Cell Signal Technology公司，鼠/兔超敏反應(yīng)組織化學(xué)試劑盒、Masson染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自福州邁新公司。

圖 1 野生型小鼠處理流程

1.4 心肌梗死模型構(gòu)建

C1ORF54敲除小鼠及野生型小鼠經(jīng)異氟烷麻醉，氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)維持麻醉，側(cè)臥位剪開皮膚，撐開器撐開第3、4肋軟骨，暴露心臟。7-0絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，依次關(guān)閉肋骨，并使用5-0絲線縫合各層皮膚，撤除麻醉，待小鼠恢復(fù)自主呼吸后拔管。假手術(shù)組小鼠在暴露心臟后不結(jié)扎左前降支，但按相同步驟進(jìn)行縫合。

1.5 心肌梗死后心臟質(zhì)量及超聲心動(dòng)圖檢測

造模后，使用小動(dòng)物超聲系統(tǒng)Visual Sonics Vevo 2100(VISUAL SONIC公司)檢測并計(jì)算各組小鼠心功能各項(xiàng)指標(biāo)，包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、短軸縮短率(FS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)。測定小鼠體質(zhì)量及心臟組織質(zhì)量并計(jì)算其質(zhì)量比。

1.6 Masson染色

小鼠于心肌梗死造模后21 d行超聲檢測后處死，并用生理鹽水行全身灌注，取出心臟浸泡于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，最終制作成厚度為5 μm的組織切片。依次進(jìn)行脫蠟水化、蘇木精染核、鹽酸酒精分化、麗春紅酸性品紅染色、冰醋酸浸洗、磷鉬酸溶液分化、苯胺藍(lán)染色、常規(guī)透明后中性樹膠封片等步驟。采用Olympus光學(xué)顯微成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法檢測Ki-67蛋白表達(dá)

各組小鼠術(shù)后第3天的心臟組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，使用檸檬酸緩沖液進(jìn)行微波加熱抗原修復(fù)。滴加過氧化酶阻斷液阻斷內(nèi)源性過氧化酶，經(jīng)非免疫動(dòng)物血清封閉后，加入稀釋后一抗孵育，加入生物素標(biāo)記二抗孵育，加入鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液，最終滴加DAB顯色液。蘇木素染核，分化并返藍(lán)，透明，中性樹膠封片。于Olympus顯微鏡下觀察心肌梗死后心肌組織中蛋白的表達(dá)情況。

1.8 Western blot法檢測p38、STAT3、β-catenin、AKT等蛋白的表達(dá)水平

在各組小鼠術(shù)后第3天的蛋白樣本中加入PMSF+RIPA裂解液并研磨、定量，制成蛋白樣本。凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。使用3%BSA室溫下封閉。按蛋白大小裁剪條帶并加入對(duì)應(yīng)一抗，于4 ℃孵育過夜。之后加入對(duì)應(yīng)一抗種屬來源的二抗，室溫下孵育1 h，使用顯影液顯影，采用Tanon成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖像結(jié)果均采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用two-way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能及纖維化程度比較

造模21 d后，心肌梗死模型組與假手術(shù)組小鼠相比，心功能各指標(biāo)均有明顯惡化，見表1。而敲除心肌梗死模型組與野生心肌梗死模型組相比，盡管兩組心率相似，但敲除心肌梗死模型組小鼠的LVEDD、LVESD和心臟質(zhì)量比明顯升高，而EF明顯降低(P均<0.01)。Masson染色結(jié)果顯示，C1ORF54基因敲除小鼠心肌纖維化程度高于野生型小鼠，見圖2。

表1 造模21 d后各組小鼠心臟超聲測定比較

注： A為野生假手術(shù)組術(shù)后21 d的心肌組織；B為野生心肌梗死模型組術(shù)后21 d的心肌組織；C為敲除假手術(shù)組術(shù)后21 d的心肌組織；D為敲除心肌梗死模型組術(shù)后21 d的心肌組織；紅色部分為正常肌纖維，藍(lán)色部分為膠原纖維

2.2 心肌組織Ki-67染色結(jié)果

小鼠左室心肌Ki-67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，心肌梗死后第3天，C1ORF54基因敲除小鼠Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)較野生型小鼠明顯升高(P均<0.05)，見圖3。

注：A為敲除心肌梗死模型組術(shù)后3 d的Ki-67染色；B為敲除心肌梗死模型組術(shù)后3 d的Ki-67與DAPI共染色；C為野生心肌梗死模型組術(shù)后3 d的Ki-67染色；D為野生心肌梗死模型組術(shù)后3 d的Ki-67與DAPI共染色；圖中綠色為Ki-67陽性細(xì)胞，藍(lán)色為DAPI核染色

2.3 p38、STAT3、β-catenin、AKT通路蛋白的表達(dá)變化

Western blot檢測結(jié)果表明，心肌梗死造模后第3天，敲除心肌梗死模型組小鼠的p38/p-P38、STAT3/p-STAT3、β-catenin的蛋白表達(dá)水平與野生型心肌梗死模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但敲除心肌梗死模型組小鼠p-AKT通路蛋白的表達(dá)水平明顯低于野生型心肌梗死模型組(P<0.01)。敲除假手術(shù)組與野生假手術(shù)組相比，各蛋白表達(dá)水平并無明顯差異。見圖4。

圖 4 各組小鼠心臟信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況

3 討論

分泌蛋白具有改善心肌梗死后組織再灌注以及舒縮功能的潛力，近年來受到廣泛關(guān)注。在哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)組中，大約2 000種蛋白具有與分泌功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)[7]，但至今大多數(shù)蛋白的生物學(xué)功能未被檢測出。Jay 等[8]發(fā)現(xiàn)了兩種具有分泌蛋白結(jié)構(gòu)和潛在的促進(jìn)組織修復(fù)功能的蛋白，包括C19ORF10(后命名為“骨髓來源生長因子”)和C1ORF54。之后的研究表明，C19ORF10可促進(jìn)血管及心肌細(xì)胞再生。但是，C1ORF54的具體功能尚不清楚。本研究顯示， C1ORF54基因的缺失可引起小鼠心肌梗死后左室收縮和舒張功能惡化，心肌纖維化程度上升，這種作用可能通過影響心肌纖維細(xì)胞的增殖來完成。這些研究結(jié)果提示，C1ORF54可能在心肌梗死后心臟重構(gòu)中發(fā)揮一定作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，C1ORF54可能通過影響IGF-1/mTOR/AKT信號(hào)通路，參與先天性彌漫性高胰島素血癥的發(fā)生發(fā)展[9]。PI3K/AKT通路在細(xì)胞增殖、遷移、蛋白合成和血管生成中發(fā)揮著重要作用[10-11]。本研究顯示，心肌梗死后C1ORF54敲除小鼠p-AKT的激活受到明顯抑制，提示C1ORF54可能通過激活A(yù)KT通路而發(fā)揮抑制心肌纖維細(xì)胞增殖的功能。我們推測，心肌梗死后C1ORF54作為分泌蛋白，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而影響心肌纖維細(xì)胞的增殖。然而，有關(guān)C1ORF54如何釋放入血液循環(huán)，以及通過何種方式調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，仍需要進(jìn)一步研究。此外，C1ORF54對(duì)心肌梗死后心肌纖維化的具體作用機(jī)制也需進(jìn)一步論證。

本研究證明，C1ORF54可以通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)心肌梗死后心肌纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善左心功能。C1ORF54有望成為心肌梗死治療的新靶點(diǎn)。