間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌梗死中歸巢的優(yōu)化策略

心肌梗死是心肌的缺血缺氧性壞死，往往導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)、功能、力學(xué)性質(zhì)的永久性改變。由于治療方法的不斷進(jìn)步，心肌梗死患者的預(yù)后得到明顯改善。基于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的細(xì)胞療法在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面有了長足發(fā)展。MSC是來源于中胚層的具有自我復(fù)制和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)特性[1-2]，能加速血管新生，促進(jìn)心肌再生。移植后的MSC可向心肌梗死區(qū)自動(dòng)歸巢。然而研究表明，只有大約3%的MSC在移植24 h后出現(xiàn)在梗死邊緣區(qū)，<1%的MSC能存活1周以上[3]。低歸巢率與低存活率嚴(yán)重影響了MSC對(duì)梗死心肌的修復(fù)作用，因此，有必要提高M(jìn)SC向靶組織特異性歸巢的效率。

1 MSC的治療作用

1999年，Makino等[4]首次利用5-氮胞苷體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，探討干細(xì)胞在心肌修復(fù)中的作用。2004年，Chen等[5]報(bào)道MSC移植可使急性心肌梗死患者左室射血分?jǐn)?shù)增加12%。在梗死心肌的功能重建方面，干細(xì)胞的旁分泌機(jī)制發(fā)揮了重要作用[6]。MSC通過表達(dá)多種趨化因子、生長因子和黏附分子，調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激發(fā)梗死區(qū)的內(nèi)源性修復(fù)。MSC對(duì)心肌梗死的治療作用包括:(1)免疫調(diào)節(jié)和抗炎；(2)抗纖維化；(3)促進(jìn)血管形成；(4)抗心肌細(xì)胞凋亡；(5)促進(jìn)心肌再生[7]。

MSC的安全性及有效性在動(dòng)物模型與臨床試驗(yàn)中均得到證實(shí)。因低表達(dá)CD40、CD80、CD86以及主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子，MSC在體內(nèi)具有免疫耐受性[7]。Guo等[8]在心肌梗死小鼠中發(fā)現(xiàn)，MSC重復(fù)植入對(duì)心肌梗死的療效優(yōu)于單次植入，進(jìn)一步證明了MSC的治療作用。一項(xiàng)研究表明，接受MSC移植的患者在移植3個(gè)月后心肌瘢痕減少，1年后心室收縮末期容積減小24%[9]。Rodrigo等[10]經(jīng)過5年隨訪，發(fā)現(xiàn)自體MSC心肌內(nèi)注射治療心肌梗死是可行和安全的。目前，MSC治療心肌梗死已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

2 MSC歸巢的機(jī)制

歸巢是干細(xì)胞療法的初始環(huán)節(jié)，通常指MSC在體內(nèi)外因素的作用下定向遷移，越過毛細(xì)血管壁至靶組織并定植存活的過程。MSC向心肌的歸巢受多種趨化因子、生長因子、黏附分子的調(diào)節(jié)，其中起關(guān)鍵性作用的是基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)和趨化因子受體4(CXCR4)[11]。梗死心肌中SDF-1表達(dá)上調(diào)并向周圍擴(kuò)散，MSC借助其質(zhì)膜受體CXCR4沿SDF-1濃度梯度遷移至受損組織。黏附于毛細(xì)血管壁的MSC跨內(nèi)皮細(xì)胞層進(jìn)入靶組織，并通過細(xì)胞黏附分子及其配體歸巢至特定靶點(diǎn)[12]。在歸巢過程中，炎性因子白細(xì)胞介素-1β促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達(dá)，進(jìn)而激活蛋白酶激活受體-1和G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)通路，溶解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)MSC遷移[13]。

目前，MSC歸巢、分化的具體機(jī)制尚未完全闡明，不同來源的MSC顯示出不同的歸巢分子表達(dá)譜[2]，這進(jìn)一步增加了研究的難度。

3 提高M(jìn)SC歸巢效率的策略

細(xì)胞療法的療效與移植細(xì)胞在靶組織的有效歸巢和準(zhǔn)確植入密切相關(guān)。通過預(yù)處理MSC、修飾靶組織、優(yōu)化移植方式，可從多方面提高M(jìn)SC的歸巢效率。

3.1 MSC預(yù)處理

3.1.1 改善擴(kuò)增模式 各組織來源的MSC在植入心肌前都需要進(jìn)行體外擴(kuò)增，以獲得足量的細(xì)胞進(jìn)行治療。然而，常規(guī)的二維培養(yǎng)方式易導(dǎo)致細(xì)胞表型的改變，如趨化因子標(biāo)志物的丟失，從而降低細(xì)胞的歸巢遷移能力。三維細(xì)胞培養(yǎng)是介于二維細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的一種技術(shù)，能最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境。有研究表明，CXCR4在球狀脂肪源性MSC中的表達(dá)水平是常規(guī)培養(yǎng)的2倍[14]。Joshi等[15]利用2 mg/mL膠原蛋白和10 μmol/L 5-氮雜胞苷構(gòu)建三維微環(huán)境，對(duì)MSC進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)胞移植后的MSC歸巢率顯著提高。

3.1.2 細(xì)胞表面工程 在細(xì)胞表面引入官能團(tuán)或生物活性物質(zhì)可提高M(jìn)SC的歸巢率，常用的引入方式有共價(jià)連接、疏水性相互作用、靜電相互作用等。Kean等[16]利用噬菌體展示技術(shù)在心肌梗死小鼠模型中鑒定CRPPR、 CRKDKC、KSTRKS、CARSKNKDC等4個(gè)具備心肌梗死靶向性的肽序列。在將該肽序列修飾的MSC注入心肌梗死小鼠模型后，小鼠心臟的MSC檢出率升高。由于心肌梗死后SDF-1高表達(dá)時(shí)段較短，而細(xì)胞因子共培養(yǎng)、病毒轉(zhuǎn)染以及常規(guī)的促CXCR4表達(dá)技術(shù)耗時(shí)較長，這些手段對(duì)于急性心肌梗死治療缺乏應(yīng)用價(jià)值。Won等[17]創(chuàng)新性地借助聚乙二醇將CXCR4分子結(jié)合于MSC細(xì)胞膜，全程僅耗時(shí)10 min，為改善MSC歸巢提供了一種臨床可行的方法。

3.1.3 基因修飾 MSC在體外分離、擴(kuò)增的過程中易丟失趨化因子受體和黏附分子(如CXCR4)，借助病毒或非病毒載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染可實(shí)現(xiàn)相關(guān)分子的再表達(dá)。且通過基因修飾，MSC能夠針對(duì)特定配體表達(dá)目標(biāo)受體，進(jìn)一步提高了MSC的歸巢率。有研究將MSC用CXCR4過表達(dá)載體反向轉(zhuǎn)染后應(yīng)用于心肌梗死大鼠模型，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組的歸巢細(xì)胞數(shù)量是未轉(zhuǎn)染組的3倍[18]。但病毒轉(zhuǎn)染法在臨床應(yīng)用時(shí)存在潛在的致癌性、致病性和免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，非病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率又偏低。Mun等[19]以微環(huán)(minicircle)作為基因表達(dá)載體，創(chuàng)新性地采用微孔法(microporation)轉(zhuǎn)染MSC，使轉(zhuǎn)染效率提高了66%。該研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4的過表達(dá)明顯增強(qiáng)了MSC向受損心肌的歸巢能力。

3.1.4 組織工程 MSC在歸巢過程中易受到缺血缺氧、炎性細(xì)胞攻擊、血流沖擊等不利因素影響而失巢或凋亡，組織工程可構(gòu)建特異性支架、補(bǔ)片或合成仿生細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的高活性注射、遷移和準(zhǔn)確歸巢。如帶有高親和力趨化因子和黏附分子的生物支架，可以彌補(bǔ)細(xì)胞在分離、擴(kuò)增過程中丟失的富含各種細(xì)胞因子的細(xì)胞外基質(zhì)[20]。在仿生基質(zhì)的構(gòu)建上，Saxena等[21]研究了MSC在不同剛度基質(zhì)上的趨化作用，結(jié)果表明MSC在軟基質(zhì)上具有更高的歸巢率。此外，He等[22]開發(fā)了一種對(duì)活性氧(ROS)敏感的含SDF-1α的納米顆粒，該納米顆粒能對(duì)組織病變中高濃度的ROS進(jìn)行降解，達(dá)到靶向釋放SDF-1α的目的，從而促進(jìn)MSC歸巢。

3.1.5 細(xì)胞因子/藥物共培養(yǎng) 在培養(yǎng)基中加入藥物或細(xì)胞因子可誘導(dǎo)細(xì)胞重要?dú)w巢分子的表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路。白細(xì)胞介素-3已被證明能夠調(diào)節(jié)CXCR4/SDF-1α軸，進(jìn)而促進(jìn)MSC遷移[23]。Popa等[24]采用30 nmol/L二氫睪酮對(duì)MSC進(jìn)行預(yù)處理，體外研究發(fā)現(xiàn)MSC向心肌切片的遷移速度增加了2倍，且整合率明顯高于對(duì)照組。另外，胰島素樣生長因子1、腫瘤壞死因子-α、γ-干擾素等也被證實(shí)可提高M(jìn)SC歸巢率[25]。

3.1.6 物理環(huán)境預(yù)適應(yīng) 讓細(xì)胞提前適應(yīng)即將面臨的環(huán)境變化，有助于提高移植細(xì)胞的存活率與植入率。(1)缺氧預(yù)處理：心肌梗死邊緣區(qū)是MSC臨床治療常用的注入靶點(diǎn)，其氧分壓通常不超過1%[26]。Heirani-Tabasi等[27]采用丙戊酸、氯化鈷等化合物模擬缺氧環(huán)境對(duì)MSC進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC在缺氧環(huán)境下過表達(dá)CXCR4，進(jìn)而明顯促進(jìn)了MSC遷移。CXCR4的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子-1α的調(diào)節(jié)[28]，這可能是CXCR4在缺氧環(huán)境中表達(dá)上調(diào)的合理解釋。此外，Hu等[29]在心肌梗死猴子模型中進(jìn)行的研究提示，0.5%低氧培養(yǎng)的MSC的遷移能力增強(qiáng)，凋亡數(shù)目減少。(2)酸性環(huán)境預(yù)處理：CXCR4對(duì)MSC遷移、歸巢和分化的調(diào)節(jié)在心肌再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Cencioni等[30]研究發(fā)現(xiàn)，酸性預(yù)處理能夠增加干細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的治療潛力，有利于梗死心肌的修復(fù)。(3)自體血清預(yù)處理：MSC雖無免疫原性，但在體外培養(yǎng)過程中受異種血清的影響，移植后宿主可能會(huì)出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)。Haque等[31]提出了兩階段的細(xì)胞體外培養(yǎng)策略。第一階段，MSC在常規(guī)培養(yǎng)基中分離和擴(kuò)增；第二階段，擴(kuò)增后的MSC在自體血清中培養(yǎng)，進(jìn)行移植前的適應(yīng)。這種短暫的適應(yīng)有助于細(xì)胞趨化因子受體的表達(dá)和組織特異性分化，從而提高細(xì)胞的歸巢率和存活率。

3.1.7 磁性靶向技術(shù) 磁性靶向技術(shù)是一種促進(jìn)MSC歸巢的新型輔助策略。將MSC與磁性納米顆粒共培養(yǎng)可使其磁化，磁化的MSC可借助特定的磁場在體內(nèi)靶向移動(dòng)，從而使分散的MSC高效地集中于靶組織并維持一定的滯留率。Huang等[32]的研究表明，借助磁性靶向技術(shù)，MSC經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射24 h后，心臟的細(xì)胞滯留率增加了2.73～2.87倍。

3.2 靶組織修飾

3.2.1 輻射預(yù)處理 低水平激光照射是干細(xì)胞靶向歸巢的有效策略，有助于梗死心肌募集MSC。輻射預(yù)處理的效果受激光的波長、功率密度、持續(xù)時(shí)間、能量密度、傳輸時(shí)間、照射類型等參數(shù)的影響。El Gammal等[33]發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死4 h內(nèi)利用804 nm波長和1 J/cm2能量密度的低水平激光處理梗死心肌能達(dá)到較好的治療效果，主要體現(xiàn)在干細(xì)胞存活率與歸巢率的提高及心肌梗死面積的減小。

3.2.2 超聲波的應(yīng)用 超聲波方向性好，穿透能力強(qiáng)，近年來也被用于促進(jìn)干細(xì)胞歸巢。超聲靶向微泡破壞技術(shù)(UTMD)可使毛細(xì)血管壁形成孔隙，從而提高其通透性，有助于MSC從血管遷移至梗死心肌，但具體機(jī)制尚不清楚[34]。Li等[35]進(jìn)行的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，UTMD不僅促進(jìn)SDF-1的分泌，而且使表達(dá)CXCR4的MSC比例增加。Chang等[36]在心肌梗死犬模型上通過對(duì)照試驗(yàn)證明了UTMD聯(lián)合冠狀動(dòng)脈內(nèi)移植能夠提高M(jìn)SC歸巢至梗死區(qū)的準(zhǔn)確性與有效性。

3.2.3 靶組織基因修飾 在MSC移植前對(duì)靶組織進(jìn)行基因修飾，有望增加歸巢相關(guān)分子的表達(dá)。Su等[37]將攜帶SDF-1α基因的腺病毒裝載在微泡載體上，利用UTMD將腺病毒轉(zhuǎn)染至梗死大鼠心肌，轉(zhuǎn)染后大鼠外周血中SDF-1α水平明顯升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MSC向心肌的歸巢數(shù)量增加，說明干細(xì)胞的歸巢數(shù)量受SDF-1α表達(dá)水平的調(diào)控。

3.2.4 其他 SDF-1α對(duì)缺血心肌具有多向性作用，既可梯度引導(dǎo)MSC歸巢至心肌損傷靶點(diǎn)，又能通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接保護(hù)心肌。心肌梗死后SDF-1α表達(dá)上調(diào)，但其在血漿中的半衰期相對(duì)較短，僅為(25.8±4.6) min[38]。二肽酰肽酶4(DPP-4)抑制劑可減少DPP-4對(duì)SDF-1α的降解，將SDF-1α維持在較高的水平[39]。MSC移植前,在心肌靶點(diǎn)人工注入趨化因子SDF-1α，有可能提高M(jìn)SC的歸巢率。此外，化療、放療以及電場在靶組織修飾中的作用也得到了深入研究。

3.3 MSC移植方式

3.3.1 注射途徑 在臨床應(yīng)用中，可采用不同的注射方式植入MSC，如動(dòng)/靜脈注射、冠狀動(dòng)脈注射、心肌內(nèi)注射。其中靜脈注射因具有創(chuàng)傷小、可重復(fù)的特點(diǎn)，應(yīng)用最廣泛，但細(xì)胞易遷移到梗死心肌以外的區(qū)域而導(dǎo)致MSC失巢凋亡或微血栓形成。研究表明，經(jīng)靜脈注射的MSC主要滯留于肺部，可能是由于體外擴(kuò)增使細(xì)胞體積增加。在注射MSC前給予血管擴(kuò)張劑，滯留于肺部的MSC數(shù)量明顯減少，歸巢率增加[40]。此外，在應(yīng)用納米生物材料注射系統(tǒng)時(shí)，直徑在10～100 nm的納米顆粒能夠有效改善循環(huán)時(shí)間[41]。

3.3.2 最佳劑量與注射時(shí)間 MSC在臨床應(yīng)用中的最佳移植時(shí)間和最佳劑量仍不明確。近期的一項(xiàng)薈萃分析表明，對(duì)于行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)的急性心肌梗死患者，術(shù)后1周內(nèi)注射不超過1×107個(gè)MSC可能是改善左室收縮功能的最佳策略[42]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死后1周進(jìn)行MSC移植，細(xì)胞存活率與歸巢率最高。過遲移植會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滯留于心臟以外的組織而失巢凋亡，過早移植則易出現(xiàn)植入不良，因?yàn)樵诩毙孕募」Ｋ兰毙云冢募〈嬖诿黠@的炎性反應(yīng)[43]。

SDF-1α/CXCR4信號(hào)通路在引導(dǎo)MSC定向遷移中至關(guān)重要。但梗死心肌表達(dá)的SDF-1α半衰期較短，心肌梗死后注射MSC可能錯(cuò)過心肌表達(dá)SDF-1α的高峰期，從而使歸巢率降低。通過調(diào)控趨化信號(hào)的表達(dá)來優(yōu)化干細(xì)胞歸巢和植入，有可能成為MSC治療的關(guān)鍵。

4 挑戰(zhàn)與展望

MSC對(duì)心肌梗死的治療作用已經(jīng)得到證實(shí)，優(yōu)化歸巢策略有助于在不增加MSC注射數(shù)量的情況下提高療效。但由于生理微環(huán)境的易變性以及個(gè)體的差異性，準(zhǔn)確歸巢的細(xì)胞比例仍然偏低。此外，MSC的臨床應(yīng)用缺乏統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的操作流程，且具體的歸巢機(jī)制仍不明確，這就限制了干細(xì)胞療法的進(jìn)一步發(fā)展。我們總結(jié)了提高M(jìn)SC歸巢的策略，但其中許多方法尚未在臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，故最優(yōu)的治療策略仍然有待探索。

建立合理的個(gè)體化干細(xì)胞治療策略有助于最大限度地減少個(gè)體差異對(duì)療效的影響，進(jìn)而更易于評(píng)估MSC的臨床療效。此外，建立特定的疾病模型對(duì)患者個(gè)體化的特征(如血管幾何形狀、血流特性、梗死區(qū)的位置)進(jìn)行參數(shù)分析，可從給藥途徑、注射部位、輸注速度等方面確定最佳的臨床治療條件。未來的研究應(yīng)著眼于更精準(zhǔn)的靶向治療，探索更標(biāo)準(zhǔn)的操作流程，開展更廣泛的臨床試驗(yàn)，以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化靶向治療的目標(biāo)。