原花青素聯(lián)合維生素E對動脈粥樣硬化大鼠的抗氧化作用*

師 豪 黃世龍 張孟柯 李 潁 胡文玉 牛美蘭

黃河科技學院醫(yī)學院，河南省鄭州市 450000

近年來以動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)為基礎的缺血性心腦血管病(包括冠心病和腦卒中)發(fā)病率逐年升高，心腦血管病已成為我國居民死亡的主要原因[1]。西藥在治療As中機制明確，取得顯著作用，但往往效果單一，且副作用較大，不良反應多。中藥以中醫(yī)理論為指導，宏觀著手，整體施治，對As這類復雜的疾病具有獨特優(yōu)勢，且其有效成分不易散失，副作用小，越來越受人們的青睞。

葡萄籽原花青素(Grape seed procyanidine，GSP)作為一種提取物，具有清除氧自由基、防止細胞老化和脂質(zhì)過氧化對細胞膜損傷、對抗血小板活化因子等多種藥理作用[2]，所以其防治As的機制可能包括多個方面。維生素E(Vitamin E，VE)是主要的抗氧化劑之一，它本身的結(jié)構(gòu)可以清除氧自由基和過氧化物，可被維生素C或氧化還原系統(tǒng)復原，繼續(xù)發(fā)揮作用[3]。通過GSP與VE的聯(lián)合抗氧化作用，進一步探究其防治大鼠As的作用機制，為今后臨床用藥以防治動脈粥樣硬化并減少西藥的毒副作用提供理論和科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級6～8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重180～220g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證編號(SCXK蘇2017-0001)，存放在黃河科技學院動物房，光照12h/d，溫度20～23℃，相對濕度40%～60%，自由飲水和攝食。

1.2 飼料 基礎飼料，高脂飼料配方(以下均為質(zhì)量分數(shù))：3%膽固醇、0.2%膽鹽、20%豬油、10%白糖及高蛋白基礎飼料(批號：201733，南京盛民科研動物養(yǎng)殖場)。

1.3 試劑及藥品 血清TC、TG試劑盒(批號：20171216)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(批號：20171207)、低密度脂蛋白膽固醇(Low densitylipoprotein cholesterin，LDL-C)試劑盒(批號：20171201)、一氧化氮(NO)試劑盒、血清超氧化物歧化酶[(Superoxide Dismutase,SOD (批號：20171218)]、抗超氧陰離子O2-試劑盒(批號：20171220)、抗羥自由基-OH試劑盒(批號：20171219)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號：20171214)，均購自南京建成生物工程研究所。免疫組化試劑盒(平頂山市慧眾源生物科技有限公司)，葡萄籽原花青素(批號：20170704，河南明瑞食品添加劑有限公司)，維生素E軟膠囊(批號：170817Q，山東盛海保健品有限公司)，維生素D3注射液(批號：20170903，哈爾濱市宏達動物藥品廠)，氯化鈉注射液(批號：1705020726，辰欣藥業(yè)股份有限公司)，阿托伐他汀鈣片(規(guī)格10mg，鄭州大學第一附屬醫(yī)院)。

1.4 實驗儀器及設備 電子天平(XJ320M,上海精科天美科學儀器有限公司)、離心機(GT16-3A , 北京時代北利離心機有限公司)、分光光度計(UV-8000, 上海元析儀器有限公司)、漩渦混勻器(DH300 , 杭州瑞誠儀器有限公司)、恒溫水浴槽(NKSY-15，常州諾基儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 造模方法 將實驗大鼠用基礎飼料喂養(yǎng)1周，適應環(huán)境后，將其分為空白組喂養(yǎng)基礎飼料和造模組喂養(yǎng)高脂飼料，空白組10只、造模組50只，早晚各添加1次飼料，自由飲水，觀察記錄飲食、二便、毛發(fā)、活動、對外界刺激的敏感度等狀況。造模期間，第1周內(nèi)腹腔注射VD360萬IU/kg，之后的第3、6、9周分別注射10萬IU/kg[4]，每周測1次大鼠體質(zhì)量。實驗9周后，空白組和模型組各隨機抽出2只，腹腔靜脈采血測血清血脂水平及抗氧化指標。

2.2 分組給藥方法 在建立高血脂模型基礎4周后，將造模組分五組：模型組；GSP+VE低、中、高劑量組；阿托伐他汀組(西藥組)，每組10只，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。GSP+VE低、中、高劑量組分別給予GSP[45mg/(kg·d)]和VE[15mg/(kg·d)]、GSP[90mg/(kg·d)]和VE[5-6][30mg/(kg·d)]、GSP[180mg/(kg·d)]和VE[60mg/(kg·d)]灌胃；阿托伐他汀組給予研磨碎的阿托伐他汀鈣片[7-8][1.05mg/(kg·d)]灌胃，以上藥物均加用生理鹽水[1.33ml/(kg·d)]；模型組灌胃同劑量的生理鹽水，連續(xù)干預4周。

2.3 樣品采集與指標測定 其他條件不變，各組大鼠于第10周稱重，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,固定四肢，打開腹腔，促凝真空管腹腔靜脈取血，3 500r/min離心10min，分離血清于-4℃冰箱保存；采血后取肝臟組織在冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重。根據(jù)試劑盒說明測其血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量，用分光光度計法測其超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、NO的含量、抗超氧陰離子O2-、抗羥自由基-OH的能力并進行對比，按照公式計算主要臟器系數(shù)和動脈硬化指數(shù)[9](Atherogenic index，AI)，分析原花青素聯(lián)合VE對臟器系數(shù)和AI的影響。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般狀況 實驗過程中，模型組3只，逐漸厭食、消瘦，還有突發(fā)的急性死亡，考慮與高脂飼料和注射大劑量維生素D3有關；GSP+VE低劑量組3只，大鼠狀況、死亡原因與模型組相似；GSP+VE中劑量組1只，狀況同模型組，因疑似肺炎，直接處死；西藥組4只，考慮到個體差異，不能耐受藥物副作用，死亡4只。

3.2 GSP聯(lián)合VE對造模大鼠臟器系數(shù)和動脈硬化指數(shù)的影響 與空白組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)、AI1、AI2均顯著升高(P<0.01)，各給藥組的肝臟指數(shù)、AI1、AI2高于空白組；與模型組相比，GSP+VE各劑量組大鼠的肝臟指數(shù)有所降低(P<0.05)，AI1、AI2均依次降低，其中高劑量組降低顯著(P<0.01)，西藥組肝臟指數(shù)升高(P<0.05)，AI1、AI2均顯著降低(P<0.01)，見表1。

表1 GSP聯(lián)合VE對大鼠肝臟指數(shù)及AI的影響

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 GSP聯(lián)合VE對造模大鼠血脂水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清的TC、TG、LDL-C的含量均增加(P<0.05)，且TC增加更顯著(P<0.01)，HDL-C的含量減少(P<0.05)，各給藥組血清TC、TG含量高于空白組，HDL-C、LDL-C含量無顯著差異；與模型組相比，各給藥組大鼠血清的TC、TG、LDL-C的含量均依次減少，HDL-C的含量依次增加(P<0.05)，見表2。

表2 GSP聯(lián)合VE對大鼠血脂水平的影響

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

3.4 GSP聯(lián)合VE對造模大鼠抗氧化水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中T-SOD的活力、抑制O2-、-OH的能力、NO的含量降低，MDA的含量升高(P<0.05或P<0.01)，各給藥組抗氧化水平趨于空白組；與模型組相比，GSP+VE各劑量組大鼠血清中T-SOD的活力、抑制O2-的能力、NO的含量依次升高(P<0.05或P<0.01)，其中低劑量組MDA含量及抑制-OH的能力無顯著變化(P>0.05)，高劑量組MDA含量降低，抑制-OH的能力增強(P<0.05)，西藥組中NO的含量、T-SOD的活力升高，MDA的含量降低(P<0.05)，抑制O2-、-OH的能力無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 GSP聯(lián)合VE對大鼠抗氧化水平的影響

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

本實驗參閱歷年相關的國內(nèi)文獻，發(fā)現(xiàn)造模方法不盡相同，如楊小蓉等[10]報道，實驗開始分4 次腹腔注射VD3共70萬IU/kg，用有不同含量膽固醇的高脂飼料探討對造模的影響，本實驗在參考文獻基礎上用3%膽固醇聯(lián)合腹腔注射大劑量VD3，9周后胸主動脈病理形態(tài)學顯示有向腔內(nèi)凸起的斑塊，內(nèi)膜增厚甚至斷裂，平滑肌細胞排列紊亂，大量泡沫細胞、淋巴細胞聚集表明復制模型成功，與文獻相符。

實驗中，造模大鼠死亡率高的原因可能是：高脂飼料中膽固醇含量過高影響口感、食欲；灌藥干預第1周，原花青素粉使用劑量過大，加之味苦，導致其厭食、體質(zhì)量下降，研究人員根據(jù)相關文獻調(diào)整給藥劑量，停藥1周后再次灌藥干預，體質(zhì)量增加狀況良好；大劑量VD3導致高鈣血癥誘發(fā)消化、泌尿系統(tǒng)功能障礙和心律失常，解剖急性死亡的大鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟表面均有白色密集的鈣化斑，甚至出現(xiàn)尿潴留。

實驗結(jié)果顯示：GSP聯(lián)合VE能提高大鼠的免疫力，延長其存活時間，西藥組雖有降血脂效果，卻對機體造成的毒副反應極大，不能耐受的機體死亡率增高。與模型組相比，GSP+VE各劑量組大鼠血脂水平依次改善，另外中、高劑量組能明顯改善血清抗氧化指標(P<0.05或P<0.01)。

大劑量VD3引發(fā)的高鈣血癥，會導致Ca的異位沉積。機體細胞處于氧化應激狀態(tài)時，活性氧(ROS)產(chǎn)生過多，細胞內(nèi)鈣超載，Ca沉積線粒體使細胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，氧自由基增多并作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，氧化終產(chǎn)物為MDA，具有細胞毒性，其含量可間接地反映出細胞損傷的程度。鈣超載時，鈣依賴性磷脂酶A2激活，使花生四烯酸(AA)生成增加，通過環(huán)加氧酶和脂加氧酶作用產(chǎn)生大量H2O2和-OH[11]。機體發(fā)生高脂血癥時，內(nèi)皮細胞損傷，一氧化氮合酶(NOS)基因表達減少，導致NO產(chǎn)生不足[12]，抑制LDL被氧化的能力下降，從而產(chǎn)生泡沫細胞進一步發(fā)展為動脈硬化。內(nèi)皮細胞損傷后，暴露出內(nèi)皮下膠原，此時在Ca2+和NO減少的作用下，血流中血小板不斷黏附聚集，血栓素A2和生長因子釋放增多，一方面促進平滑肌細胞增殖和動脈基質(zhì)層蛋白質(zhì)合成，降低血管壁的順應性；另一方面激活凝血因子，啟動了內(nèi)源性凝血過程，因此嚴重的As潰瘍是導致血栓形成的常見原因。GSP聯(lián)合VE的抗氧化機制是原花青素通過回收脂溶性維生素E和減少DNA氧化損傷來發(fā)揮作用[13]。與模型組相比，GSP+VE各劑量組也正是通過作用于以上機制的一個或多個途徑從而達到降脂抗氧化的目的，使得AI1、AI2的值有所降低，其中高劑量組顯著降低(P<0.01)，AI值升高提示機體發(fā)生As的可能性增加，說明GSP聯(lián)合VE能延緩大鼠As的形成。

本實驗表明，GSP聯(lián)合VE具有改善血脂水平和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，從而降低動脈粥樣硬化過程中活性自由基對血管的損害，為其對As的抗氧化作用機制做了初步探究，為今后保健品的開發(fā)利用和臨床中西聯(lián)合用藥提供新依據(jù)。