腸道病毒D68型和C96型的研究進展

劉陽陽，劉洪波

(桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 桂林 541100)

腸道病毒(enterovirus，EV)隸屬于小核糖核酸病毒目、小RNA病毒科。在國際病毒分類委員會發(fā)表的最新病毒分類第十次報告中，將其分為EV A～J 9組，其中A～D組為人類EV[1]。1999年，Oberste等[2]首次提出了分子生物學定型人類EV血清學的方法。隨著生物學信息的不斷補充、完善及分子生物學分型方法的不斷改進，新的EV血清型不斷被鑒定出來，現(xiàn)已編碼至EV123[1]。EV引起的感染多為無癥狀隱性感染，但仍可進一步導致多種急、慢性疾病的發(fā)生，常見的有急性弛緩性麻痹、急性無力脊髓炎、急性出血性結(jié)膜炎、無菌性腦膜炎、心肌炎、手足口病及新生兒全身性感染等，嚴重者甚至可危及生命[3]。目前，在我國已報道的EV檢出型別有EV71、EVD68、EV73、EV75、EV90、EV96、EV97[4-5]及EV118[6]等，但除EV71、CA16外其他型別多為偶有檢出，并因尚未引起疫情而未受到廣泛重視。隨著相關(guān)病例的不斷涌現(xiàn)，新EV(EVD69、EVC96)正逐漸引起大家的重視。現(xiàn)就EVD68及EVC96的生物學特征、分子流行病學、致病性及治療等方面的研究進展予以綜述。

1 流行病學

1.1流行地區(qū) EVD68于1962年首次從美國加利福尼亞州伯克利市4例急性呼吸道感染及肺炎患兒的樣本中分離[7]。之后很長一段時間關(guān)于EVD68感染的報道極少，直到2014年夏季在美國和加拿大多個地區(qū)出現(xiàn)了兒童因EVD68感染導致急性呼吸道疾病的大規(guī)模暴發(fā)[8]，自此以后EVD68才引起了全球的廣泛關(guān)注，并陸續(xù)在多個地區(qū)出現(xiàn)過暴發(fā)。目前，EVD68在我國北京、上海、重慶等多個地區(qū)均有檢出。

EVC96自2000年首次分離于孟加拉國一例急性弛緩性麻痹患者的糞便標本后，陸續(xù)在亞歐大陸許多國家(哥倫比亞、斯洛伐克、芬蘭、玻利維亞、菲律賓及中國等)的急性弛緩性麻痹患者或健康人群甚至環(huán)境標本中均有發(fā)現(xiàn)[9]。根據(jù)相關(guān)報道及美國國立生物技術(shù)信息中心中的毒株信息發(fā)現(xiàn)，其在我國流傳較廣，在云南、廣東、山東、新疆、河南等多地均有檢出[10-13]。目前，在全球范圍內(nèi)未曾出現(xiàn)EVC96的相關(guān)疫情報道，但其在我國的檢出率逐年升高。

1.2流行時間與易感人群 EVD68常于早秋至冬季流行[13]，根據(jù)地區(qū)不同可稍有差異[14]。其可感染各個年齡段人群，但以成人為主。荷蘭的一項調(diào)查顯示，EVD68在50～59歲年齡組檢出的陽性率最高[12]，性別分布則較一致[3]，但在兒童和青年的感染中更易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

EVC96具有典型的EV流行特點，主要在夏季至早秋流行，以嬰幼兒為主要感染對象，其中又以學齡前兒童最為多見，考慮與學齡前兒童的良好衛(wèi)生習慣尚未養(yǎng)成及免疫力較低有關(guān)，其在成人中的感染多為自限性的隱性感染，尚無相關(guān)重癥病例報道。

1.3分子流行病學 EV的流行方式主要有常見血清型的持續(xù)流行和特定的血清型集中暴發(fā)兩種，后者是疾病出現(xiàn)暴發(fā)流行的重要原因之一；作為RNA病毒的一種，其具有變異率高的特點，主要進化方式有基因重組和基因突變。在人體免疫或藥物壓力作用下，病毒不斷地進化從而導致新的血清型出現(xiàn)。病毒的基因重組又包括型間重組和型內(nèi)重組，有研究表明EV型內(nèi)重組的發(fā)生率遠高于型間重組[15]。同時隨著病毒流行時間越久，傳播距離越遠，其發(fā)生重組和突變的概率也隨之增加，故致使現(xiàn)今流行毒株與原型株有了較大差異。

目前，EVD68流行的主要有4個血清型及數(shù)個分支，包括原型株Fermon[7]及A、B、C 3個基因型[16]。其中，A型和B型包含了近年世界范圍內(nèi)流行的大多數(shù)毒株，C型目前流行程度較??；同時在一次暴發(fā)中，常出現(xiàn)多個基因型的共同流行。2014年，美國暴發(fā)的EVD68毒株以A1、B1、B4及B5亞型為主，加拿大流行的主要毒株為A2亞型；且在歐洲國家(意大利、荷蘭等)也發(fā)現(xiàn)了A1、A2、B1和B2亞型感染的病例[17-21]。在亞洲國家(泰國、日本等)發(fā)現(xiàn)有B型及C型共同流行的現(xiàn)象，中國則以A2亞型和B2亞型為主[22]。且在2011年以前，在中國的EVD68感染病例中A2亞型占主導地位，但在2014年的調(diào)查中則以B2亞型為主導，2011—2014年兩者均有發(fā)現(xiàn)[22]。Xiang等[23]認為，不同亞型同時流行或交替流行的現(xiàn)象提示在此期間發(fā)生了EVD68的基因重組。同時，他們通過進行序列分析發(fā)現(xiàn)在發(fā)生基因重組的同時，EVD68的基因突變現(xiàn)象也在各型別間十分常見，尤其是近年檢測到的序列發(fā)生了很大變異。Laine等[24]發(fā)現(xiàn)，除了在5′非編碼區(qū)有一或兩段堿基的缺失外，部分序列在VP1區(qū)也出現(xiàn)3個堿基缺失的現(xiàn)象，這可能是造成相關(guān)疾病暴發(fā)流行的原因之一。此外，在我國檢測到的毒株基因序列也存在氨基酸缺失的現(xiàn)象[16]，但目前尚未出現(xiàn)暴發(fā)性流行。Xiang等[23]的研究顯示，在我國成人群體中EVD68的血清中和抗體較高，可能是尚未出現(xiàn)暴發(fā)的原因之一。但由于EV的重組速度極快，故其仍有在我國大規(guī)模暴發(fā)的風險，應保持警惕。

通過對EVC96的基因序列進行分析發(fā)現(xiàn)，其在非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)有廣泛的重組現(xiàn)象發(fā)生[18]。但因EVC96出現(xiàn)較晚、分離數(shù)量較少，故目前對其研究仍較少。EVC96發(fā)生基因重組的概率極高，胡嵐[15]研究發(fā)現(xiàn)，包括新疆、河南、安徽、湖北、西藏等多個地區(qū)的中國分離株均存在型間重組，且各毒株重組情況各異，十分復雜，其中3株新疆分離株之間存在型內(nèi)重組的現(xiàn)象，Xu等[25]的研究也得出一致結(jié)論。Smura等[26]對芬蘭分離株的研究也進一步證實了EVC96發(fā)生基因重組的普遍性。同時，胡嵐[15]還對12株中國分離EVC96毒株的VP1序列進行了分析，將其分為A～G共7個基因型，每一株或兩株分離株就代表了一種基因型，這與湯晶晶等[27]的研究結(jié)果一致。可見，在我國傳播的EVC96變異十分大。除出現(xiàn)重組外，一些EVC96毒株還存在部分序列在VP1區(qū)出現(xiàn)3個堿基缺失的現(xiàn)象，但對其致病性的影響暫不明確。EVC96在我國多個省份流行的毒株各異，親緣關(guān)系遠近不一[15,27]。雖然目前尚未出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)，但其變異速度快、檢出率日漸升高，故亟待進一步研究。

2 感染機制及致病性

2.1感染機制 EVD68以呼吸道傳播為主。其最適生長溫度為33 ℃，而非EV常見的37 ℃，并對酸和熱不穩(wěn)定，這些生物學特征與人類鼻病毒極為相似，在發(fā)現(xiàn)初始甚至被認為是人類鼻病毒的一種，被命名為人類鼻病毒87型，后利用分子生物學手段進行分析后才被重新命名為EVD68，這種生物學特性也決定了其更容易入侵呼吸道并通過呼吸道分泌物傳播的致病特點。Uncapher等[28]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)氨酸酶能通過催化唾液酸水解使EVD68對海拉細胞的黏附減少，表明唾液酸可能是其潛在的受體。隨后Liu等[29]的研究進一步證實了細胞表面的唾液酸是EVD68的特異性受體，而人體呼吸道上皮細胞表面存在的唾液酸為EDV68在呼吸道進行復制增殖創(chuàng)造了條件。Imamura等[30]發(fā)現(xiàn)，EVD68對主要存在于上呼吸道的α2～6鏈唾液酸的親和力大于α2～3鏈唾液酸，這可能是EVD68更易造成上呼吸道感染的原因。同時與下呼吸道相比，上呼吸道的pH值較高而溫度較低，更加適宜EVD68復制，這可能也是其以上呼吸道感染為主的原因之一[30]。但某些EVD68毒株不僅可通過唾液酸受體感染細胞，也可感染表面缺乏唾液酸的細胞，如2014年在美國暴發(fā)流行時檢出的US/MO/14-18947及US/KY/14-18953毒株，研究發(fā)現(xiàn)其感染對唾液酸的依賴性低，神經(jīng)氨酸酶處理不能有效影響病毒復制，說明EVD68可能存在其他介導感染的受體[31]。2016年，在Wei等[31]發(fā)現(xiàn)了EVD68的首個蛋白受體神經(jīng)元特異表達的細胞間黏附分子5(intercelluar adhesion molecule-5，ICAM-5)，其可與EVD68特異性結(jié)合，敲除ICAM-5或加入ICAM-5-Fc重組蛋白競爭性結(jié)合病毒后，EVD68的感染和復制均明顯受到抑制；在不能被EVD68感染的非洲綠猴腎細胞中外源表達ICAM-5后，病毒的復制及感染能力顯著增強，同時ICAM-5還可增強上述兩株非唾液酸受體依賴的EVD68毒株的病毒感染性，說明該受體能夠介導進化變異過程中唾液酸依賴和非唾液酸依賴的EVD68毒株對宿主的感染，同時ICAM-5-Fc重組蛋白能有效阻斷EVD68的入侵與復制。

除上述EVD68侵入呼吸道的機制外，目前對EV的感染機制研究比較有限。包括EVC96在內(nèi)的多數(shù)EV傳播方式均為糞-口傳播，一般認為病毒最先侵及呼吸道或消化道黏膜組織，其在腸黏膜中進行的復制可持續(xù)數(shù)周，在此過程中子代病毒可隨糞便排出體外，感染初期病毒還可進入血液循環(huán)出現(xiàn)毒血癥。當病毒到達次級靶器官之后對其進行攻擊，從而產(chǎn)生相應的臨床癥狀，這也是多數(shù)EV的致病機制。但隨著病毒的不斷進化，新的血清型不斷出現(xiàn)，各自不同的生物學性狀、基因結(jié)構(gòu)均不同程度地影響了病毒致病機制的改變。因此，盡快探明病毒感染機制，從而阻斷其在人群中的傳播，是目前EV防治工作中迫切需要解決的問題之一。

2.2致病性 EVD68與其他EV感染的不同之處在于其以呼吸道感染為主，可引起患者出現(xiàn)咳嗽、流涕、發(fā)熱、呼吸困難等典型上呼吸道感染癥狀，甚至可出現(xiàn)因呼吸困難、血氧不足需要住院治療的情況，同時也可表現(xiàn)出顯著的發(fā)熱、肌痛、咳嗽、腹瀉等典型EV感染癥狀，此外EVD68還可引起無支氣管痙攣和有哮喘病史感染者的再次發(fā)病[11]。有研究表明，EVD68的感染與哮喘發(fā)病率有密切聯(lián)系[32]。且EVD68可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病急性弛緩性麻痹、急性無力脊髓炎的發(fā)生[33]。已證實，EVD68可引起脊髓灰質(zhì)中前角細胞的損傷[34]。其在神經(jīng)系統(tǒng)的致病機制與EV71十分相似，在Messacar等[35]的研究中，12例EVD68感染的患兒均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。Kreuter等[10]在1例腦膜炎患兒腦脊液中檢出EVD68，并確認EVD68感染為致死疾病病因，提示EVD68可能具有嗜神經(jīng)性。但與同樣具有嗜神經(jīng)性的EV71不同，EVD68感染累及神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)主要出現(xiàn)在手臂及腦神經(jīng)，而腦干是EV71感染的最易受累部位。Hixon等[36]設計了一系列小鼠模型實驗證實，EBD68部分毒株也存在神經(jīng)系統(tǒng)的致病性。且Wei等[31]發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元特異表達的ICAM-5是EVD68的特異性受體，也證實了這一點。此外，EVD68還可與其他呼吸道病毒共同感染，進一步加重感染[37]。

目前，我國的EVC96毒株多分離于手足口病、急性弛緩性麻痹、急性無力脊髓炎患兒標本。Xu等[25]的研究認為，EV96-SZ/GD/CHN/2014分離株可單獨導致手足口病的發(fā)生，但除此之外尚無EVC96與其他疾病有確切關(guān)系的證據(jù)。

3 診斷、治療及預防

3.1臨床診斷 目前，臨床對于腸道感染的初步診斷仍依靠醫(yī)師的經(jīng)驗性診斷。實驗室診斷主要包括病毒分離、血清學方法和分子生物學方法，其中病毒分離是經(jīng)典的方法，但由于進行分離培養(yǎng)的周期過長故難以做到早期診斷，易導致病情延誤甚至誤診。血清學方法可鑒定的型別有限，同時各型別之間的交叉反應可能造成結(jié)果的假陽性。分子生物學手段(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應和下一代測序技術(shù)等)正不斷發(fā)展，但因?qū)υO備、人員要求較高，故距離大規(guī)模應用于臨床診斷尚有一段距離；而以VP1為目標片段研制的探針，有望成為高效的特異性檢測手段。但目前臨床針對EVC96及EVD68尚無特異性診斷方法。

3.2治療與預防 EV感染治療目前仍以廣譜抗病毒治療為主。對于EVD68引起的呼吸道嚴重感染除盡早改用抗病毒治療外，還應在需要時使用呼吸機機械通氣或插管輔助呼吸，而對EVD68引起的嚴重神經(jīng)系統(tǒng)病變(急性無力脊髓炎)，美國疾控中心至今仍無推薦用藥。Hixon等[36]研究認為，氟西汀對運動障礙或病毒負荷沒有影響，而地塞米松治療甚至可以加重損傷、提高死亡率、增加病毒載量。目前，以人類EV的小RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)為靶點的抗病毒藥物正在研發(fā)中，但其具體藥物作用機制尚未明確。且其他EV抑制劑也在研發(fā)中，如Pleconaril。Hernández[38]進行的雙盲試驗發(fā)現(xiàn)，其治療組的病毒培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰性快于安慰劑組，死亡率低于安慰劑組，故有望成為EV的有效治療手段，但目前在我國尚未批準上市。

疫苗接種是EV感染的最佳防控手段，目前我國僅有3種EV71型疫苗批準上市，其他血清型的疫苗暫時仍處空白或研發(fā)階段。且對EVC96的VP1表位疫苗的研發(fā)正在進行中，EVD68則尚無相關(guān)報道。

4 小 結(jié)

EV呈全球化流行，且變異極快，在不斷重組、進化中新血清型不斷增加，雖以隱性感染為主，但多個型別曾在全球多個地區(qū)暴發(fā)疫情。目前，除EV71、CA16等致病性明確、流行時間長的重要病原體已得到廣泛重視外，許多散發(fā)病原體并未得到重視，但這些病原體造成大規(guī)模暴發(fā)的潛能卻不容忽視，如EVD68感染已在歐美多個地區(qū)出現(xiàn)過疫情。因此，進一步建立完善的EV監(jiān)測系統(tǒng)、不斷改進分型方法，同時不斷探究人類EV的致病性及其傳播、循環(huán)和進化模式并加快對抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)均是EV感染防控工作中迫切需要解決的問題。