藥食兩用中藥飲片微生物污染現(xiàn)狀考察與研究

高新貞，劉 枕，王 穎，王彥厚

（淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086）

中藥飲片是介于農(nóng)產(chǎn)品和藥品之間的產(chǎn)品[1]，有些品種既是生產(chǎn)中成藥的原料，又可經(jīng)簡單處理用于患者，還可作為食品用于日常生活，稱為藥食兩用中藥飲片。近年，如枸杞、菊花、黑芝麻、山楂，及價格相對昂貴的阿膠、人參均作為藥食兩用中藥飲片，使用量與日俱增。但這類飲片若被微生物污染，會產(chǎn)生很多不良影響：一方面表現(xiàn)在微生物中的致病菌和條件致病菌對人體健康有直接威脅；另一方面，被微生物污染的藥品，其理化性質(zhì)改變會降低藥品的有效性，甚至某些被微生物和酶降解的產(chǎn)物會導致使用者產(chǎn)生不良反應，甚至死亡[2]。另外在實際生活中，大多數(shù)服用者對微生物缺乏了解，對服用被微生物污染的飲片后身體產(chǎn)生的不良反應與飲片微生物污染的相關性知之甚少，更無從論證與考察。因此制定合理的飲片微生物檢查標準，有效控制其質(zhì)量，使其真正起到保健養(yǎng)生、食為藥用的功能至關重要。為此筆者從醫(yī)院、藥店、超市、農(nóng)貿(mào)市場分別隨機購買了27批常用藥食兩用中藥飲片，先按《中國藥典》要求進行符合性檢驗，然后參考《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》相關國家標準檢查需氧菌總數(shù)和控制菌，考察飲片的污染現(xiàn)狀，為下一步合理制定標準、控制質(zhì)量提供參考依據(jù)。同時通過比較不同來源、不同包裝的同品種中藥飲片的微生物污染狀況，闡述包裝、儲存、運輸?shù)闹匾浴?/p>

1 材料與儀器

1.1 實驗樣品

分別從醫(yī)院、藥店、超市、農(nóng)貿(mào)市場購買枸杞、薄荷、金銀花、蒲公英、菊花共25份散裝樣品；從超市購買單劑量包裝的枸杞、菊花各1份樣品，包裝標示飲用方法為95 ℃以上熱水沖泡3～5 min。以A、B、C、D、E分別表示枸杞、薄荷、金銀花、蒲公英、菊花；以阿拉伯數(shù)字表示購買來源，分別為1淄博市張店區(qū)某藥店、2淄博市周村區(qū)某超市、3淄博市周村區(qū)某醫(yī)院、4淄博市張店區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場、5淄博市周村區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場、6淄博市張店區(qū)某超市。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：1065575）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：3304006）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：3303050）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：3304009）；麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：3304008）；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：3104094）。上述培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，已進行適用性檢查，均符合規(guī)定。

腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號：150804）；RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號：150914）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：150806）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（150801）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號：150916）；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（批號：151117）；MUG培養(yǎng)基（批號：150128）。上述培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，已進行適用性檢查，均符合規(guī)定。

1.3 試劑

沙門菌干制生化鑒定試劑盒（批號：170914）；大腸埃希菌干制生化鑒定試劑盒（批號：170712）；凍干血漿（批號：171025）；色氨酸肉湯（批號：170801）。上述試劑均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.4 菌種及菌液制備

接種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 102]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphiB)[CMCC(B)50 094]的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)24 h。取上述新鮮培養(yǎng)物1 ml，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至小于100 cfu/ml，備用。上述菌種均由山東省食品藥品檢驗研究院提供。

1.5 儀器

BPX-162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊）；LRHS-150-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進）；MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊）；GHP-9160N隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）；YXQ-LS-70A全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊）；HC-B10001電子天平（慈溪華徐衡器）；HR40-ⅡB2生物安全柜（青島海爾）；Vitek2 compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國梅里埃）；奧林巴斯CX31生物顯微鏡 （日本奧林巴斯）；ZF-2三用紫外儀（上海安亭）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥典符合性檢驗

根據(jù)《中國藥典》2015年版四部[3]通則1106、1107的規(guī)定進行試驗，考察中藥飲片質(zhì)量是否符合《中國藥典》要求。

2.1.1 標準 按照通則1107非無菌藥品微生物限度標準表4對研粉口服用貴細飲片、直接口服及泡服飲片的規(guī)定，上述飲片可歸類為直接泡服的中藥飲片，應不得檢出沙門菌（10 g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應小于104cfu（1 g）。

2.1.2 試驗方法 按通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進行檢查。

2.1.2.1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查 供試液制備和預培養(yǎng) 取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 ml，混勻，作為1:10供試液，23 ℃培養(yǎng)2 h，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑10倍梯度稀釋，分別制成1:100、1:1000和1:10000供試液。

選擇和分離培養(yǎng) 取經(jīng)預培養(yǎng)后的1:10、1:100、1:1000、1:10000供試液各1 ml分別接種至10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24～48 h，上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)18～24 h。

結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應培養(yǎng)管為“+”，否則為“-”。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從通則1106表2查1 g供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。結(jié)果見表1。

由表1可見27批次樣品的耐膽鹽革蘭陰性菌定量試驗中，有24批次樣品紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上無菌落生長，耐膽鹽革蘭陰性菌小于10 cfu/g；有3批次大于104cfu/g，分別為來源于兩家農(nóng)貿(mào)市場的枸杞和一家藥店的菊花。

表1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查結(jié)果

2.1.2.2 沙門菌檢查 供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品10 g接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，33 ℃培養(yǎng)18～24 h。

選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物0.1 ml接種至10 mRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)18～24 h；取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）平板上，33 ℃培養(yǎng)18～48 h；用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，33℃培養(yǎng)18～24h，或采用其他適宜方法進一步鑒定。

結(jié)果判斷 按照通則1106相關要求進行。結(jié)果見表2。

由表2可見，27批樣品在XLD平板上均有菌落生長，經(jīng)初步生化鑒定均為非沙門菌。對菌落形態(tài)一致的21批樣品再次分離純化，進行儀器鑒定，結(jié)果97 %概率為泛菌屬。其余6批因試劑不足，未進行進一步鑒定。

表2 沙門菌檢查結(jié)果

2.2 增項檢查

按同類食品要求增加檢查項目，并進行質(zhì)量考察和研究?？紤]到藥食兩用中藥飲片常用于制作糕點、飲品、冷食菜等，筆者參考國家標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》中的 GB/T 4789.21-2003[4]、GB/T 4789.23-2003[5]及GB/T 4789.24-2003[6]3個標準，發(fā)現(xiàn)冷食菜、糕點、蜜餞、飲料等食品均有菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的檢驗要求。藥典已規(guī)定了沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，考慮到大腸埃希菌為口服制劑必檢項目，結(jié)合現(xiàn)有試驗條件，選擇菌落總數(shù)、大腸埃希菌和分布廣泛的金黃色葡萄球菌3個項目對中藥飲片進行檢查，并將菌落總數(shù)統(tǒng)一到藥典術(shù)語：需氧菌總數(shù)。為模擬藥食兩用中藥飲片在服用時進行沸水沖泡的過程，筆者選取了市場需求量大的枸杞和菊花共計12批次，95 ℃水浴處理10 min前后，分別對其進行需氧菌總數(shù)、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌檢查。

2.2.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法 取樣品25 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基225 ml，45 ℃保溫振搖混勻，作為1:10供試液。10倍梯度稀釋制成1:100、1:1000、1:10000的供試液。參考2.1項結(jié)果可見，樣品污染較嚴重，因此樣品處理前計數(shù)試驗從1:100做起，處理后計數(shù)試驗從1:10做起。采用平皿法中的傾注法，計數(shù)結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，平板上若無菌落生長，以＜1乘以稀釋倍數(shù)的值報告。結(jié)果見表3、表4。

2.2.2 大腸埃希菌檢查方法 取1:10供試液10 ml接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基，43 ℃培養(yǎng)48 h；取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)72 h，選取典型菌落進行分離、純化、染色鏡檢。結(jié)果見表3、表4。

2.2.3 金黃色葡萄球菌檢查方法 取1:10供試液10 ml接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)72 h，選取典型菌落進行分離、純化、鑒定。結(jié)果見表3、表4。

表3 樣品處理前需氧菌總數(shù)、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌檢查結(jié)果

表4 樣品處理后需氧菌總數(shù)、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌檢查結(jié)果

3 討論

按《中國藥典》2015年版四部[3]通則1106、1107的相關要求進行符合性檢驗，27批樣品中有3批耐膽鹽革蘭陰性菌超標，不合格率達11.1 %。有文獻[7]報道，相對安全的微生物指標，空氣中的微生物濃度為1～104cfu/L；水中的微生物濃度為1～104cfu/ml；生活飲用水100 cfu/ml。由表3可見，處理前有1批枸杞達到106cfu/g，2批枸杞、2批菊花接近105cfu/g，均超過上述指標，且接近《美國藥典》38版對使用前用沸水處理的植物中需氧菌總數(shù)≤105cfu/g限度標準[2]。由此可見，藥食兩用中藥飲片微生物污染現(xiàn)狀不容樂觀，建議加強對藥食兩用中藥飲片的微生物檢驗。

27批樣品均未檢出沙門菌，符合現(xiàn)行藥典的相關規(guī)定。但在XLD平板上生長的菌落經(jīng)分離、純化、鑒定，多為泛菌屬。泛菌屬為條件致病菌，服用人群不同，如新生兒、嬰幼兒及體弱者，致病風險可能不同[3]。1批購自農(nóng)貿(mào)市場的枸杞，樣品編號A-4，經(jīng)處理后在EMB平板上仍有菌落生長，經(jīng)染色鏡檢確定為革蘭陽性芽孢菌。此類菌耐熱性高，尤其對體弱者致病性強，應嚴格控制?！睹绹幍洹贰ⅰ稓W洲藥典》、《日本藥局方》中對類似于中國的中藥飲片的藥品，均規(guī)定了需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、大腸埃希菌的檢查[2]。因此現(xiàn)行《中國藥典》對中藥飲品的微生物限度標準不足以排除其潛在風險，建議對中藥飲片增加微生物檢驗項目。

由表4可見，經(jīng)處理后的樣品需氧菌總數(shù)大大降低，下降2～4個數(shù)量級，僅有3批達到102cfu/g，處于相對安全的水平。另外，樣品處理前，2批檢出金黃色葡萄球菌，2批檢出大腸埃希菌。樣品經(jīng)處理后，均未檢出相應控制菌。因此中藥飲片在無特殊服用要求時，建議盡量熱水泡服或經(jīng)過其它加熱方式處理，能有效殺滅微生物，降低服用風險。

微生物生長的條件是營養(yǎng)、空氣、水分等。由結(jié)果可見，2批單劑量包裝的中藥飲片，處理前后，計數(shù)平板均無菌落生長；控制菌檢查無論是藥典規(guī)定項目，還是筆者增加的檢查項，均未檢出。這與此類產(chǎn)品前期經(jīng)過初步凈制，單次用量獨立包裝，有些還抽真空有關。USP＜1112＞中介紹了利用水分活度控制藥品中微生物生長的一般方法[1]，通過對飲片進行適度干燥處理，并采用適宜的包裝材料及包裝方式等途徑控制其水分活度，對防止微生物污染有較大的影響。監(jiān)管相對較松的農(nóng)貿(mào)市場，飲片大都直接堆放在地上，銷售人員不注意衛(wèi)生，控制菌檢出率則相對偏高。建議在生產(chǎn)、儲存、運輸過程中嚴格管理，采用有效的包裝形式、合適的儲存條件，防止微生物的多次污染。

本文試驗過程中，僅參考《中國藥典》四部[3]進行樣品檢查，尚未進行方法適用性試驗。因此單劑量獨立包裝樣品在計數(shù)檢驗時均無菌落生長，且未檢出控制菌，是否與經(jīng)過防腐處理相關有待考察。