紫蘇葉-黃芩藥對抑制神經(jīng)氨酸酶活性的最佳配比研究*

汪靜宜 魯銀均 吳巧鳳#

1 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

2 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

中醫(yī)學認為，紫蘇葉可行氣和胃，解表散寒；黃芩擅清熱燥濕，瀉火解毒。臨床上，兩藥常以不同比例配伍出現(xiàn)在治療流感的方劑中。神經(jīng)氨酸酶（NA）是流感病毒表面的一種包膜糖蛋白，在流感病毒的傳播過程中發(fā)揮重要作用。本文以藥對對NA活性的抑制率為評價指標，采用輻射設計法確定紫蘇葉-黃芩藥對的不同配比，通過響應曲面法評價不同配比的藥對與抑制NA活性的關系，以確定紫蘇葉-黃芩藥對的最佳配比。

1 材料

1.1 藥材：紫蘇葉（批號：171001；產(chǎn)地：浙江）和黃芩（批號：170701；產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）均購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學中藥資源教研室俞冰副教授鑒定，分別為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的葉和唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

1.2 試劑：神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒P0309[包含1ml神經(jīng)氨酸酶熒光底物2′-（4-methylumbelliferyl）-D-N-acetylneuraminic acid（MUNANA）、50μl神經(jīng)氨酸酶、10ml神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液和1.20ml Milli-Q水，碧云天生物技術研究所]；生理鹽水（批號：B16010402，浙江國境藥業(yè)有限公司）；奧司他韋膠囊（批號：M1025，瑞士巴塞爾豪夫邁·羅氏有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器：熒光酶標檢測儀（FLUOstar OPTIMA，德國BMG公司）；熒光酶標板（96孔，美國COSTAR公司）；電子分析天平（AB135-S，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超速離心機（Centrifuge 5810R，德國Eppendorf公司）；超聲波清洗器（KQ5200，昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 藥對的配伍設計與制備：實驗采用輻射設計，將二維坐標分為8個等分[1]，得到9種不同的配伍比例（1:0、5:1、5:2、3:2、1:1、2:3、2:5、1:5、0:1），具體見圖1（紫蘇葉:黃芩以蘇-芩表示）。分別精密稱取紫蘇葉、黃芩粗粉，混勻，每份均設為15g，用20倍量的水煎煮2次，每次1h，趁熱過濾，合并濾液，濃縮濾液至相當于含生藥量0.5g/ml，得相應的藥對提取液，于4℃冷藏，臨用時以生理鹽水稀釋至所需濃度。

圖1 紫蘇葉-黃芩藥對9個不同配比

2.2 神經(jīng)氨酸酶抑制率的測定[1-2]：取96孔熒光酶標板，設置酶對照組、空白對照組、陽性對照組（奧司他韋，5個不同濃度：0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml）及藥對組（9個不同配比），每組3孔。各組加入神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液70μl/孔，再各加神經(jīng)氨酸酶10μl/孔（空白組不加），陽性對照組加5個不同濃度的藥液，藥對組加9個不同配比的藥液（各稀釋7個濃度）。振蕩混勻約1min后，37℃下孵育2min，以使抑制劑和神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，然后每孔加入10μl神經(jīng)氨酸酶熒光底物，振蕩混勻約1min后，37℃下孵育20min后進行熒光測定（激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm），計算抑制率及半抑制濃度（IC50）。測定結果見表1（其中奧司他韋的IC50為0.021mg/ml，酶對照組抑制率視為0）。各組數(shù)據(jù)與酶對照組均具有顯著性差異（P＜0.05）。

由表1可知，藥對配比在1:1左右時，其IC50最小，提示紫蘇葉-黃芩藥對在1:1配比時對神經(jīng)氨酸酶抑制 活性作用最佳。

表1 各組對NA活性的抑制率（n=3）

2.3 藥效學模型：中藥具有多成分多靶點共同作用的特點，采用二次多項式描述紫蘇葉和黃芩兩藥合用的量效曲線，響應指數(shù)表示其相互作用強度。將響應指數(shù)減1，以0為典型的加和作用，便于繪圖。結果見圖2。

2.4 相互作用評價：在三維響應曲面模型圖中，顏色深淺表示兩藥相互作用的強度。當響應指數(shù)接近于0時，藥物間表現(xiàn)為相加作用；大于0時，表現(xiàn)為拮抗作用；小于0時，表現(xiàn)為協(xié)同作用。指數(shù)值越高，則相互作用強度越大，響應曲面圖中表現(xiàn)為顏色接近于淺色或深色兩端。X軸表示不同劑量的黃芩單味藥，Y軸表示不同劑量的紫蘇葉單味藥，Z軸表示藥對在不同劑量下的抑制率。采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)用-x±s表示，采用Matlab軟件進行擬合模型確定參數(shù)。以流感病毒NA活性抑制率為評價指標，擬合三維響應曲面模型，見圖2。當紫蘇葉、黃芩配比在1:0.92～1:1.67之間時，其協(xié)同作用顯著（協(xié)同作用強度-0.80）。其他配比協(xié)同作用較弱，或產(chǎn)生相互作用甚至具有拮抗作用。

圖2 藥對三維響應曲面圖

3 討論

本文采用底物熒光檢測法考察紫蘇葉-黃芩藥對不同配比對神經(jīng)氨酸酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)紫蘇葉-黃芩藥對配比為1:1時，IC50最小。結合前期對“中國方劑數(shù)據(jù)庫”中含紫蘇葉-黃芩藥對的古方統(tǒng)計分析結果，發(fā)現(xiàn)1:1配比出現(xiàn)的頻率最高（占總數(shù)的25.6%）；在主治普通感冒及流感的方劑中，1:1配比出現(xiàn)的頻率也最高（占總數(shù)的44.4%），與本實驗結果一致，從而反映藥對在方劑中使用的科學性。響應曲面圖是由特定的響應值與對應自變量所構成的三維圖，可直觀地反映出各自變量對響應值的影響[2-3]。響應曲面法可定性、定量地研究藥物間藥效學相互作用規(guī)律，并能尋找最佳閾值反應范圍[4]；輻射設計是一種從全局考慮藥物不同配伍比例的方法，相比僅憑臨床經(jīng)驗的少數(shù)幾個參數(shù)設計更全面合理。輻射設計-響應曲面分析法兩者合用，目前已應用于多種藥對[1，5]與相關藥效間的最佳配比研究。本文采用該方法探討紫蘇葉-黃芩藥對不同配伍比例對抑制神經(jīng)氨酸酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)紫蘇葉:黃芩在1:0.92～1:1.67時，協(xié)同作用明顯，結合古方分析，最終確定1:1為抗流感病毒神經(jīng)氨酸酶最佳配比。本文結果可為紫蘇葉-黃芩抗流感病毒配伍比例的選擇提供參考，并為其他相關研究提供思路與方法。

4 參考文獻

[1]陳高，吳巧鳳，張小霞，等.黃連-厚樸藥對9個配伍比例對抑制神經(jīng)氨酸酶活性的影響[J].中成藥，2017，39(7)：1394-1397.

[2]崔文燕，劉素香，趙艷敏，等.響應曲面法優(yōu)化黃花敗醬總皂苷提取工藝及體外促進腸平滑肌收縮活性[J].中草藥，2016，47（12）：2078-2083.

[3]呂佳妮，陳素紅，徐娟華.鐵皮石斛根中石斛多糖的響應面法提取優(yōu)化研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2014，49（6）：459-461.

[4]史旭芹，尚爾鑫，唐于平，等.基于響應面法對當歸-黃芪配伍養(yǎng)血補血功效相互作用研究[J].藥學學報，2012，47（10）：1375-1383.

[5]黃美艷，唐于平，尚爾鑫，等.基于響應面法對歸芎藥對活血效應相互作用研究[J].中國藥理學通報，2012，28（10）：1407-1412.