槐耳清膏聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2及Survivin基因表達(dá)的影響

沈云飛 詹建偉

肺癌是一種發(fā)病率和死亡率排在首位的惡性腫瘤，已經(jīng)連續(xù)多年成為人體健康的頭號(hào)殺手[1]。目前臨床上針對(duì)肺癌患者的治療方法主要是以化療為主的綜合治療手段[2-3]，但是其臨床療效因腫瘤細(xì)胞的藥物耐受性受到限制，特別是肺癌A549/DDP細(xì)胞多耐藥性的產(chǎn)生已經(jīng)成為肺癌藥物治療的主要障礙[4-5]。近年研究顯示，多種中藥提取物能夠有效抑制人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的增殖[6-7]，臨床研究顯示，槐耳清膏可能是通過(guò)活化MAPK（mitogen-activated protein kinase，絲裂原活化蛋白激酶）信號(hào)通路影響A549細(xì)胞凋亡[8]。本研究探索槐耳清膏與順鉑聯(lián)合刺激對(duì)于人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞以及耐藥株A549/DDP細(xì)胞Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、B 細(xì)胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）以及細(xì)胞凋亡重復(fù)桿狀病毒抑制劑5（Survivin）基因表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試 劑 順鉑（規(guī)格：50mL:50mg，批號(hào)2015040108，齊魯制藥有限公司）；槐耳清膏（規(guī)格：20g×6袋，批號(hào)J201605314，江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司）；完全培養(yǎng)基（規(guī)格：500mL/KIT，批號(hào)2015032142，Zrbiorise）；Epigentek 全蛋白抽提試劑盒（批號(hào)2016012403，武漢艾美捷科技有限公司）；Bax檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2015032451，武漢默沙克生物科技有限公司）；Bcl-2檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2015085312，R&D systems）。Survivin 檢 測(cè) 試 劑 盒 （ 批 號(hào)2015012413，R&D systems）；A549/DDP（DDP，cisdichlorodiamineplatinum，順鉑）細(xì)胞株（規(guī)格：1×106cells/T25培養(yǎng)瓶，批號(hào)2015010304，武漢普諾賽生命科技有限公司）。A549細(xì)胞株（規(guī)格：1×106cells/T25培養(yǎng)瓶，批號(hào)20150500213，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞學(xué)研究所）；Rneasy MiNi Kit（50）（批號(hào)2016032412，Qiagen）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將冷凍保存的細(xì)胞株復(fù)蘇后在5%CO2濃度飽和濕度和37℃條件下采用完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%的鏈霉素和青霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，其中A549/DDP細(xì)胞株培養(yǎng)基除上述成分外另加入6μmol/L的DDP，于實(shí)驗(yàn)前兩天更換不含有DDP的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，A549/DDP細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。

1.3 藥物制備 將10g槐耳清膏溶解于100mL無(wú)血清PRMI-1640培養(yǎng)液中，分別制成0、1.0、3.0、5.0、7.0和9.0mg/mL的槐耳清膏溶液，同時(shí)以未加槐耳清膏的無(wú)血清PRMI-1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。

1.4 Real-time PCR檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)：Bax上游引物：5’-CAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3’；Bax 下游引物：5’-ACTCGGAAAAAGACCTCTCGG-3’。Bcl-2上 游 引 物 ：5’-ATCCAGGATAACGGAGGCTG-3’；Bax下游引物：5’-AGAAATCAAACAGAGGCCGCA-3’。Survivin 上游引物：5’-CCACCAGCCTTCCTATGG GC-3’；Bax下游引物：5’-AAGACAAAACAGGAGCA CAGTTG-3’。以GAPDH基因作為內(nèi)參，GAPDH基因的上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’；GAPDH 基因下游引物為 5’-TGTAGACCATGT AGTTGAGGTCA-3’。總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄：將第13復(fù)孔中每種藥物濃度刺激后的細(xì)胞抽提總RNA。將抽提的總RNA采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為：10μL 2×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液；20μL DEPC 水；1.2μL引物（50mM）；2μL總 RNA；0.2μL逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)程序?yàn)?42℃，30min；85℃，10min。Realtime PCR 反應(yīng)體系：10μL 1×定量 PCR Master Mix，上 、 下 游 引 物各 0.08μL，2μL cDNA，0.4μL Taq DNA 聚合酶，8μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃，3min；95℃，30s；55℃，20s；40cycles。

1.5 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞株Bax、Bcl-2以及Survivin蛋白表達(dá)情況 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞以細(xì)胞濃度為2×106/瓶分別接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后分別加入含槐耳清膏濃度為 0、1.0、3.0、5.0、7.0和9.0mg/mL細(xì)胞培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度3復(fù)孔，然后分別加入12μg/mL濃度的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48h后停止培養(yǎng)，使用Epigentek全蛋白抽提試劑盒抽提總蛋白，抽提完成后4℃，10 000r/min離心10min，取上清，采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Bax、Bcl-2以及Survivin濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），組間數(shù)據(jù)比較分析采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物作用濃度組合刺激A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin mRNA表達(dá)的影響 槐耳清膏與順鉑聯(lián)合使用的情況下，隨著槐耳清膏濃度的升高，A549細(xì)胞Bax基因mRNA表達(dá)逐漸升高，Bcl-2、Survivin基因mRNA表達(dá)逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表 1。

2.2 不同藥物作用濃度組合刺激A549/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin基因mRNA表達(dá) 槐耳清膏與順鉑聯(lián)合使用的情況下，隨著槐耳清膏濃度的升高，A549/DDP細(xì)胞Bax基因mRNA表達(dá)逐漸升高，Bcl-2、Survivin基因mRNA表達(dá)逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表 2。

表1 不同藥物組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin mRNA表達(dá)情況（RQ值，±s）

表1 不同藥物組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin mRNA表達(dá)情況（RQ值，±s）

注：RQ：relative quantity，相對(duì)表達(dá)量；空白對(duì)照組：未加藥物刺激；Bax：Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤2；Survivin：凋亡抑制

組別空白對(duì)照組12μg/mL DDP刺激組1.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組3.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組5.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組7.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組9.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組F值P值例數(shù)3 3 3 3 3 3 3 Bax 1.00±0.03 1.05±0.03 1.24±0.04 2.43±0.16 4.25±0.27 8.21±0.58 19.79±0.52 10.21＜0.01 Bcl-2 1.00±0.02 1.01±0.02 1.02±0.02 0.53±0.03 0.37±0.02 0.24±0.04 0.13±0.02 4.54 0.01 Survivin 1.00±0.04 1.02±0.05 1.00±0.03 0.87±0.02 0.54±0.03 0.23±0.04 0.08±0.01 7.12＜0.01

表2 不同藥物組A549/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin mRNA表達(dá)（RQ值，±s）

表2 不同藥物組A549/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin mRNA表達(dá)（RQ值，±s）

注：RQ：relative quantity，相對(duì)表達(dá)量；空白對(duì)照組：未加藥物刺激；Bax：Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤2；Survivin：凋亡抑制

組別空白對(duì)照組12μg/mL DDP刺激組1.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組3.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組5.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組7.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組9.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組F值P值例數(shù)3 3 3 3 3 3 3 Bax 1.00±0.02 1.02±0.02 1.31±0.05 2.47±0.13 4.36±0.25 7.85±0.73 20.21±0.43 12.43＜0.01 Bcl-2 8.01±0.53 5.03±0.02 4.89±0.03 3.57±0.02 1.32±0.04 0.51±0.02 0.21±0.03 9.17＜0.01 Survivin 1.00±0.02 1.03±0.06 0.92±0.02 0.65±0.02 0.44±0.02 0.19±0.02 0.06±0.01 7.63＜0.01

表3 不同藥物組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)情況（ng/L，±s）

表3 不同藥物組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)情況（ng/L，±s）

注：RQ：relative quantity，相對(duì)表達(dá)量；空白對(duì)照組：未加藥物刺激；Bax：Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤2；Survivin：凋亡抑制

組別空白對(duì)照組12μg/mL DDP刺激組1.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組3.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組5.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組7.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組9.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組F值P值例數(shù)3 3 3 3 3 3 3 Bax 1.40±0.20 1.80±0.30 2.30±0.90 3.20±1.10 3.50±1.30 4.90±1.20 5.80±1.90 8.54＜0.01 Bcl-2 5.40±2.30 4.30±2.00 2.80±1.00 2.40±1.50 1.50±0.90 1.40±0.80 0.90±0.40 9.38＜0.01 Survivin 11.20±2.30 8.60±2.10 7.80±3.10 6.40±2.10 5.10±1.10 3.50±1.20 1.20±0.90 10.55＜0.01

2.3 不同藥物作用濃度組合對(duì)A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)的影響 槐耳清膏與順鉑聯(lián)合使用的情況下，隨著槐耳清膏濃度的升高，A549細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量逐漸升高，Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)量逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 不同藥物作用濃度組合對(duì)A549/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)的影響 槐耳清膏與順鉑聯(lián)合使用的情況下，隨著槐耳清膏濃度的升高，A549/DDP細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)量逐漸升高，Bcl-2、Survivin蛋白量表達(dá)逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表 4。

3 討論

研究顯示，肺癌的發(fā)生可能與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的平衡被打破有關(guān)[9]，細(xì)胞凋亡是一種機(jī)體細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，包含一系列基因激活、表達(dá)以及調(diào)控過(guò)程[10]。肺癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程受到多種基因的表達(dá)調(diào)控，在其凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中主要包含三個(gè)途徑，分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑和線粒體途徑[11]。其中在線粒體途徑中最重要的調(diào)控基因是Bcl-2基因家族，本研究中的Bcl-2基因和Bax基因均來(lái)自于該基因家族，而這兩個(gè)基因的作用剛好相反，其中Bcl-2基因主要是在抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，Bax基因主要發(fā)揮的是促凋亡作用[11]。另外本研究中另一種Survivin基因是IAP家族的一員，是一種很強(qiáng)的細(xì)胞凋亡抑制因子，有研究顯示其主要的功能是抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂和血管生成，另外在腫瘤細(xì)胞的耐藥性中也發(fā)揮著非常重要的作用[12]。

表4 不同藥物組A549/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)的情況（ng/L，±s）

表4 不同藥物組A549/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)的情況（ng/L，±s）

注：RQ：relative quantity，相對(duì)表達(dá)量；空白對(duì)照組：未加藥物刺激；Bax：Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤2；Survivin：凋亡抑制

組別空白對(duì)照組12μg/mL DDP刺激組1.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組3.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組5.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組7.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組9.0 mg/mL+12μg/mL DDP刺激組F值P值例數(shù)3 3 3 3 3 3 3 Bax 1.70±0.50 2.30±0.80 3.40±1.30 6.50±2.40 9.60±3.10 11.20±4.60 20.21±9.80 15.71＜0.01 Bcl-2 24.30±7.50 19.80±5.50 15.40±4.90 12.60±5.10 8.50±2.50 5.40±2.10 1.60±0.70 17.98＜0.01 Survivin 14.80±5.60 11.60±5.20 9.50±2.90 8.10±3.50 7.70±3.10 4.20±2.10 1.50±0.80 14.68＜0.01

槐耳清膏與順鉑聯(lián)合刺激作為一種中西醫(yī)結(jié)合治療方法能夠顯著抑制人肺癌細(xì)胞A549以及耐藥性細(xì)胞A549/DDP的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的耐藥性已經(jīng)得到研究證實(shí)，但是其作用機(jī)制并不十分清楚[13]。本研究以Bax、Bcl-2以及Survivin基因作為研究對(duì)象，在僅使用順鉑刺激時(shí)A549細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因的表達(dá)明顯低于A549/DDP細(xì)胞，這點(diǎn)也正是A549/DDP細(xì)胞的耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，即在A549/DDP細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因高表達(dá)，與此同時(shí)凋亡基因低表達(dá)，其作用導(dǎo)致A549/DDP細(xì)胞能夠進(jìn)行不斷增殖而變成癌細(xì)胞。有研究顯示，A549/DDP細(xì)胞之所以能夠具有耐藥性是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)Bcl-2過(guò)表達(dá)而導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）和細(xì)胞色素C的蛋白的表達(dá)下調(diào)，這也與本研究結(jié)果相符[14]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)和ELISA檢測(cè)，槐耳清膏與順鉑聯(lián)合作用后，A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)逐漸升高，Bcl-2、Survivin基因的表達(dá)逐漸降低，說(shuō)明槐耳清膏與順鉑聯(lián)合作用是通過(guò)上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)且下調(diào)抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的凋亡，另外也說(shuō)明槐耳清膏能夠逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的耐藥性作用。然而本研究還處于體外試驗(yàn)階段，筆者接下來(lái)計(jì)劃通過(guò)蛋白抑制劑與槐耳清膏共同刺激A549細(xì)胞檢測(cè)Bax、Bcl-2以及Survivin蛋白的表達(dá)情況，并通過(guò)細(xì)胞凋亡模型研究槐耳清膏的作用機(jī)制，并通過(guò)動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。

綜上所述，槐耳清膏與順鉑聯(lián)合使用能夠顯著提高人肺癌細(xì)胞A549和A549/DDP的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，降低抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。