流感病毒生命周期研究進(jìn)展

朱艷慧，王升啟,2

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

流行性感冒又稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。流感可分為季節(jié)性流感和大流行性流感。季節(jié)性流感每年都有發(fā)生，而且流感種類非常多，需要對(duì)正在傳播的病毒株進(jìn)行密切監(jiān)視，并針對(duì)預(yù)測(cè)的病毒株每年提供更新的疫苗接種。大流行流感是一種高致病性流感，每隔一段時(shí)間就會(huì)發(fā)生一次，病毒株會(huì)在人群中迅速傳播，導(dǎo)致發(fā)病率和致死率急劇上升，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[1-3]。如1918～1920年H1N1亞型“西班牙流感”、1957～1958年H2N2亞型“亞洲流感”、1968～1969年 H3N2亞型“亞洲流感”、1977～1978年H1N1亞型“香港流感”、2009年首先在墨西哥暴發(fā)的H1N1亞型流感[4]、2013年首先在中國(guó)報(bào)道的H7N9亞型流感[5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,每年有290 000～650 000死亡人數(shù)與流感引起的呼吸道疾病有關(guān)，造成了巨大的疾病負(fù)擔(dān)[6]。

1 流感病毒生物學(xué)簡(jiǎn)介

流感病毒是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的分節(jié)狀單鏈負(fù)義RNA病毒，病毒顆粒通常為球形，直徑80～120 nm，也有絲狀的長(zhǎng)約幾微米[7]。流感病毒可以借助空氣迅速傳播，引起呼吸道感染，導(dǎo)致免疫缺陷的感染者患上嚴(yán)重的并發(fā)癥，如肺炎或急性呼吸衰竭等。根據(jù)病毒基質(zhì)蛋白1（matrix 1，M1）和核蛋白（nucleoprotein，NP）的抗原性不同，可將流感病毒分為A（influenza A virus，IAV）、B（influenza B virus，IBV）、C（influenza C virus，ICV）和 D 型（influenza D virus，IDV）。IAV、IBV和ICV可以感染和引起人類呼吸道疾??；IDV主要感染牛，目前還不知道是否可以感染人類。IAV還能夠感染多種動(dòng)物，如鳥(niǎo)、豬、馬、海洋哺乳動(dòng)物和其他宿主，引起大流行，根據(jù)其表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的分子特征不同又可分為不同亞型，迄今鑒定了18種HA亞型（H1～H18）和11種NA亞型（N1～N11）[8-9]。IAV的基因組包括8個(gè)獨(dú)立RNA片段，編碼至少12種功能明確的蛋白。NS片段編碼宿主抗病毒反應(yīng)拮抗劑NS1（nonstructural protein 1）和核輸出蛋白NS2（也稱為NEP），M片段編碼基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2，此外還有受體結(jié)合蛋白血凝素HA，唾液酸破壞酶神經(jīng)氨酸酶NA，核蛋白NP，聚合酶蛋白PA、PB1和PB2。PB1片段還編碼N40蛋白和促凋亡蛋白PB1-F2，后者在病毒致病性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。3種膜蛋白HA、NA和M2組成IAV的脂質(zhì)雙層膜，脂膜下是M1基質(zhì)蛋白。病毒內(nèi)部的8個(gè)單鏈RNA被包裹在病毒核糖核蛋白復(fù)合物（viral ribonucleoprotein complexes，vRNP）中，vRNP的蛋白質(zhì)成分由核蛋白NP和聚合酶蛋白PA、PB1、PB2 組成[11]。

2 流感病毒復(fù)制的生命周期

流感病毒復(fù)制的生命周期涉及多個(gè)步驟：①病毒通過(guò)唾液酸受體黏附于細(xì)胞表面；②病毒通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用發(fā)生內(nèi)化；③病毒包膜與核內(nèi)體膜融合；④病毒基因組vRNA從病毒粒子脫殼并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；⑤在核定位信號(hào)（nuclear localization signals，NLS）幫助下，vRNA 進(jìn)入細(xì)胞核；⑥互補(bǔ)RNA（complementary RNA，cRNA）的合成和病毒基因組vRNA的復(fù)制；⑦以進(jìn)入細(xì)胞核的vRNA為模板合成mRNA；⑧包膜蛋白（HA和NA）的合成和糖基化；⑨其他蛋白的合成；⑩病毒包膜蛋白插入細(xì)胞膜子代病毒粒子的組裝和出芽病毒粒子的釋放[12]。

2.1 吸附

流感病毒與呼吸道上皮細(xì)胞的唾液酸受體特定結(jié)合。不同物種的上皮細(xì)胞表達(dá)不同的唾液酸受體，甲型流感病毒株識(shí)別不同類型的唾液酸受體，這使得人畜共患病傳播困難。人流感病毒株識(shí)別人類肺和上呼吸道上皮細(xì)胞唾液酸α-2，6半乳糖受體，動(dòng)物流感病毒株識(shí)別鳥(niǎo)類和豬的上皮細(xì)胞唾液酸α-2，3半乳糖受體。但人類下呼吸道也可以表達(dá)唾液酸α-2，3半乳糖受體，允許高致病禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza，HPAI）感染肺泡巨噬細(xì)胞，使得H5N1在人類中廣泛傳播導(dǎo)致原發(fā)性肺炎的發(fā)生。流感病毒HA介導(dǎo)與唾液酸受體的結(jié)合。HA是三聚體分子，HA1是宿主細(xì)胞受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，而HA2是體內(nèi)融合的關(guān)鍵位點(diǎn)。流感病毒HA蛋白形成膜遠(yuǎn)端口袋作為結(jié)合位點(diǎn)，其中190螺旋（殘基 190～198）、130環(huán)（殘基 135～138）和 220環(huán)（殘基221～228）形成口袋的三面，保守殘基Tyr98、Trp153、His183和Tyr195位于口袋底部，構(gòu)成口袋的氨基酸殘基通過(guò)氫鍵和范德華力與唾液酸受體相互作用。另外，第二個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)位于HA1和HA2之間，只有唾液酸α-2，3半乳糖受體具有較弱的結(jié)合親和力，唾液酸α-2，6半乳糖受體不能結(jié)合到這個(gè)位點(diǎn)[13]。

2.2 內(nèi)吞

流感病毒可通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的以及網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴的內(nèi)吞途徑感染細(xì)胞[14]。細(xì)胞內(nèi)吞包括吞噬作用和胞飲作用。吞噬作用通常是指特定細(xì)胞消化大顆粒和細(xì)菌，如巨噬細(xì)胞；胞飲作用是指負(fù)責(zé)細(xì)胞對(duì)液體、大分子和病毒等小病原體的吸收。胞飲作用涉及幾個(gè)不同的機(jī)制：巨胞飲、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，以及不依賴網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白的通路。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是依賴受體和結(jié)合配體的濃度進(jìn)入網(wǎng)格蛋白包裹的囊泡（clathrin-coated pits，CCP）發(fā)生的。這些囊泡離開(kāi)質(zhì)膜后與其他內(nèi)吞囊泡或核內(nèi)體發(fā)生融合。對(duì)于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，涉及2條可能的途徑：①配體和結(jié)合受體靶向細(xì)胞表面已經(jīng)存在的CCP，此過(guò)程需要G蛋白偶聯(lián)受體參與；②結(jié)合配體招募網(wǎng)格蛋白和輔助因子形成新的CCP。通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)途徑進(jìn)入的流感病毒顆粒，有94%都是在病毒結(jié)合位點(diǎn)形成新的CCP發(fā)生內(nèi)吞作用[15]。

2.3 融合

流感病毒被內(nèi)吞后，首先經(jīng)歷第一個(gè)酸化步驟早期核內(nèi)體（pH6），然后被運(yùn)輸至晚期核內(nèi)體（pH5），酸化環(huán)境觸發(fā)融合，并將基因組運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中[16]。在流感病毒感染過(guò)程發(fā)揮重要作用的核內(nèi)體是由Rab蛋白和其他因子調(diào)控的。在早期核內(nèi)體中，內(nèi)化的物質(zhì)被運(yùn)輸?shù)讲煌康牡兀夯厥盏呐潴w和受體被返回到細(xì)胞表面，而降解的物質(zhì)被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w。Rab5參與早期核內(nèi)體運(yùn)輸，Rab11或Rab4調(diào)控運(yùn)輸需要返回到細(xì)胞表面的配體和受體，Rab7和Rab9調(diào)控運(yùn)輸?shù)饺苊阁w和晚期核內(nèi)體[17-18]。流感病毒融合依賴HA的幾個(gè)特性，這些特性是在病毒脫殼之前的復(fù)制周期中啟動(dòng)的。在流感病毒粒子中，HA分子具有高度的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，處于亞穩(wěn)態(tài)，疏水融合肽隱藏在分子底部。病毒粒子進(jìn)入核內(nèi)體后，其低pH環(huán)境觸發(fā)病毒包膜與核內(nèi)體膜的融合，并啟動(dòng)融合事件：HA前體多肽（HA precursor polypeptide，HA0）構(gòu)象變化和M2離子通道打開(kāi)。由于pH誘導(dǎo)HA0構(gòu)象改變，將埋藏的HA2融合肽擠壓到HA分子的遠(yuǎn)端。新形成的HA2 N端融合肽進(jìn)入HA三聚體分子內(nèi)部，與離子化的殘基連接，形成具有融合能力的中性pH結(jié)構(gòu)。融合肽插入核內(nèi)體膜導(dǎo)致兩膜合并。當(dāng)插入的HA2的兩端靠近時(shí)，兩膜發(fā)生融合，形成明顯的半融合中間體，然后形成融合孔。病毒核的酸化有助于vRNP從核內(nèi)體通過(guò)融合孔釋放到細(xì)胞質(zhì)中[19]?？傊鞲胁《綡A介導(dǎo)病毒膜與核內(nèi)體膜的融合過(guò)程：首先，HA被N端裂解至融合肽，從HA0到HA1和HA2的裂解對(duì)于在核內(nèi)體發(fā)生的隨后的構(gòu)象變化和允許融合肽暴露至關(guān)重要；其次，在融合過(guò)程中三聚體協(xié)同工作；第三，在出芽過(guò)程中，HA被分割成脂質(zhì)微區(qū)，有助于后續(xù)的融合活性[20]。另外，流感病毒的包膜含有高水平的膽固醇，膽固醇的消耗嚴(yán)重影響病毒粒子感染細(xì)胞的能力。這種消耗可能直接影響病毒融合或病毒復(fù)制中的其他早期事件[21]。

2.4 脫殼和進(jìn)入細(xì)胞核

流感病毒脫殼和進(jìn)入細(xì)胞核在病毒生命周期中是必不可少的。病毒感染后30～90 min，大約30%的IAV顆粒在“周?chē)恕眳^(qū)域與晚期核內(nèi)體融合脫殼。抑制病毒M2離子通道和核內(nèi)體酸化可防止IAV脫殼。流感vRNP通過(guò)病毒HA分子和M2離子通道的協(xié)同作用從核內(nèi)體釋放。HA介導(dǎo)的病毒膜與核內(nèi)體膜融合后提供一條通道，與M1基質(zhì)蛋白分離的vRNP可以通過(guò)該通道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。M2通過(guò)酸化病毒粒子內(nèi)部環(huán)境介導(dǎo)M1與vRNP的分離[22]。細(xì)胞質(zhì)中的vRNP通過(guò)經(jīng)典的α/β1輸入蛋白依賴性核導(dǎo)入途徑進(jìn)入細(xì)胞核[23]。但秦沖等[24]報(bào)道，流感病毒脫殼后，vRNP分別釋放到細(xì)胞質(zhì)中，單個(gè)的vRNP經(jīng)歷3個(gè)階段的主動(dòng)核導(dǎo)入過(guò)程，并在細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)2種擴(kuò)散模式。第一階段，vRNP 以0.34±0.07 μm/s的平均速度從“周?chē)恕眳^(qū)域移動(dòng)到細(xì)胞核邊界；第二階段，vRNP通過(guò)振動(dòng)運(yùn)動(dòng)與核膜結(jié)合并穿過(guò)核膜，整個(gè)過(guò)程持續(xù)33～89 s；第三階段，在細(xì)胞核內(nèi)，vRNP進(jìn)行快速和單向運(yùn)動(dòng)，以0.2～1.1 μm/s的瞬時(shí)速度歷經(jīng)幾秒鐘到達(dá)核位點(diǎn)。但是，并非所有vRNP都能進(jìn)入細(xì)胞核，完成轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。

2.5 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制

流感病毒在細(xì)胞核中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。流感病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）是由PA、PB1和PB2亞基組成的異三聚體，以病毒RNA（vRNA）為模板，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中合成細(xì)胞核中有帽狀、多聚腺苷酸化的mRNA，在復(fù)制過(guò)程中合成模板RNA（cRNA）和vRNA。以宿主pre-mRNA的5′帽子RNA片段為引物啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，RdRp合成mRNA的啟動(dòng)子分別位于vRNA的5′和3′末端，是分別由13和12個(gè)保守核苷酸組成的部分雙鏈螺旋RNA結(jié)構(gòu)[25]。PB1亞基行使RNA聚合酶功能；PB2亞基結(jié)合細(xì)胞premRNA的5′帽子結(jié)構(gòu)，形成有帽子的病毒mRNA；PA上的N端結(jié)構(gòu)域切割5′帽子結(jié)構(gòu)下游的10～13個(gè)核苷酸，產(chǎn)生帶帽子的RNA引物。然后將引物轉(zhuǎn)移到PB1亞基上的聚合酶活性位點(diǎn)，PB1將其作為引物，以病毒基因組作為模板合成帽狀mRNA，最后mRNA被多聚腺苷酸化[26-27]。vRNA的復(fù)制分2個(gè)階段，首先形成vRNA的cRNA，然后復(fù)制該cRNA產(chǎn)生vRNA。在此過(guò)程中，NP通過(guò)RNA結(jié)合和病毒聚合酶結(jié)合依賴性機(jī)制參與病毒基因組的復(fù)制。另外，NP是一種單泛素化蛋白，在體內(nèi)可被USP11去泛素化。USP11的去泛素酶活性可以抑制流感病毒vRNA和cRNA的復(fù)制[28]。NP的泛素化位點(diǎn)為K184，K184突變NP可以抑制病毒基因組的復(fù)制[29]。

2.6 組裝和出芽

流感病毒顆粒的組裝、出芽和釋放是病毒生命周期的最后，關(guān)系著病毒的存活和致病能力。流感病毒的組裝和出芽需要幾個(gè)必不可少的步驟：①將所有病毒（亞病毒）成分帶到組裝位點(diǎn)，即非極化細(xì)胞的質(zhì)膜或者極化上皮細(xì)胞的頂端質(zhì)膜；②所有病毒成分必須有序地相互作用，才能組裝成具有傳染性的病毒粒子；③在組裝位點(diǎn)亞病毒成分相互作用使質(zhì)膜向外彎曲啟動(dòng)芽胞的形成；④在芽柄上附著的膜必須融合，使病毒顆粒從宿主細(xì)胞分離并釋放到細(xì)胞外環(huán)境中[30]。流感病毒都是在受感染的極化上皮細(xì)胞的頂端質(zhì)膜組裝和出芽的。由于vRNP是在細(xì)胞核內(nèi)合成的，因此必須先將vRNP從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)到極化上皮細(xì)胞的頂端質(zhì)膜。M1是一種具有核定位信號(hào)的蛋白質(zhì)，可以進(jìn)入細(xì)胞核，與vRNP和NEP相互作用，形成一個(gè)（Crm1-RanGTP）-NEP-M1-vRNP“菊花鏈”復(fù)合物被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[31-32]。另外，病毒包膜蛋白（HA、NA和M2）也被運(yùn)輸?shù)讲《靖腥炯?xì)胞的頂端質(zhì)膜，在質(zhì)膜上以離散的斑塊進(jìn)行聚集組裝。病毒糖蛋白HA和NA參與出芽位點(diǎn)的選擇。Scheiffele等[33]對(duì)純化的流感病毒顆粒進(jìn)行生化分析發(fā)現(xiàn)，HA和NA與具有脂質(zhì)筏溶解特性的質(zhì)膜相結(jié)合，流感病毒的出芽就發(fā)生在脂質(zhì)筏結(jié)構(gòu)上。形成的流感病毒顆粒通過(guò)膜分裂從細(xì)胞中釋放，NA裂解細(xì)胞表面唾液酸受體使病毒離開(kāi)感染的細(xì)胞，釋放的流感病毒繼續(xù)感染其他細(xì)胞，至此流感病毒完成了一個(gè)完整的生命周期。被流感病毒感染的細(xì)胞發(fā)生死亡，死亡機(jī)制多種多樣，包括蛋白合成中斷和細(xì)胞凋亡等。由于病毒在細(xì)胞死亡前持續(xù)釋放數(shù)小時(shí)，許多呼吸道上皮細(xì)胞受到影響并在幾個(gè)復(fù)制周期內(nèi)死亡。

總之，禽流感病毒和人流感病毒分別與細(xì)胞表面唾液酸α-2，3或α-2，6半乳糖受體結(jié)合，然后流感病毒以細(xì)胞骨架依賴的方式通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)或網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴的方式進(jìn)行內(nèi)吞。病毒粒子通過(guò)Rab5和Rab7陽(yáng)性的早期和晚期核內(nèi)體進(jìn)行運(yùn)輸，在低pH環(huán)境下，HA介導(dǎo)病毒膜與晚期核內(nèi)體膜融合脫殼，釋放到細(xì)胞質(zhì)中的不同vRNP片段分開(kāi)進(jìn)入細(xì)胞核，完成轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，然后所有亞病毒成分在質(zhì)膜完成組裝和出芽，最后釋放到周?chē)h(huán)境中。

最近感染高致病性禽流感病毒H5N1和H7N9病例的增加，引發(fā)了人們對(duì)流感病毒大流行潛力的擔(dān)憂。對(duì)流感病毒的生命周期進(jìn)行綜述，有助于更好地理解流感病毒的致病機(jī)制，為更全面開(kāi)發(fā)藥物的作用靶點(diǎn)提供參考。