蘇氨酸醛縮酶的研究進(jìn)展

黎軍，張志雄，楊金亮，李學(xué)英

1.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563000；2.四川大學(xué) 生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610000

蘇氨酸醛縮酶（threonine aldolases，TAs）主要存在于微生物和植物中[1-9]，以磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）為輔酶，在生理?xiàng)l件下催化蘇氨酸裂解為甘氨酸和乙醛，承擔(dān)蘇氨酸分解代謝和甘氨酸合成的功能[8]。在體外，TAs可以催化不同類型的醛與α-氨基酸發(fā)生醇醛縮合反應(yīng)，生成具有2個(gè)手性中心的β-羥基-α-氨基酸[10-13]，而后者為一類存在于氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、腎上腺素、屈昔多巴、萬古霉素、鞘脂菌素等許多活性醫(yī)藥物成分（active pharmaceutical ingredient，API）中的核心片段[14-19]。因此，TAs在生物合成中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。TAs在催化過程中可以嚴(yán)格控制產(chǎn)物α-碳位的立體構(gòu)型（e.e.＞99%），而對(duì)β-碳位的立體構(gòu)型控制相對(duì)較弱，產(chǎn)物常為一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體[7-12]。在生物合成中如何控制產(chǎn)物βC位的立體構(gòu)型，以及酶催化過程的分子機(jī)制，是近年來研究TAs的熱點(diǎn)。

1 TAs的分類

根據(jù)其對(duì)立體異構(gòu)的蘇氨酸的活性的不同，可將TAs分為L-TAs和D-TAs這2大類。L-TAs可以進(jìn)一步分為特異性裂解L-蘇氨酸的L-TA（EC4.1.2.5）、特異性裂解L-別-蘇氨酸的L-allo-TA（EC4.1.2.49）、同時(shí)對(duì)L-蘇氨酸和L-別-蘇氨酸均具有裂解活性的低選擇性L-low-TA（EC4.1.2.48）等3個(gè)類型。D-TAs中，目前僅發(fā)現(xiàn)低特異性的 D-TA（EC4.1.2.42）[8,14]。L-TAs和 DTAs發(fā)揮作用必須依賴于輔酶PLP，PLP是維生素B6的活性形式。序列相似性和系統(tǒng)發(fā)生分析表明L-TAs和D-TAs基因是2個(gè)相互獨(dú)立進(jìn)化的基因家族。L-TAs屬于天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族，為PLP依賴的Ⅰ型折疊酶；D-TAs屬于丙氨酸消旋酶超家族，為PLP依賴的Ⅲ型折疊酶[8]。

2 TAs的結(jié)構(gòu)

幾個(gè)種屬來源的L-TA、L-low-TA、L-allo-TA、D-TA的晶體結(jié)構(gòu)已解析（表1），為理解TAs的分子催化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

表1 TAs的晶體結(jié)構(gòu)列表

2.1 L-TAs的結(jié)構(gòu)

L-TAs為222對(duì)稱的同源四聚體，每個(gè)單體包含1個(gè)大的結(jié)構(gòu)域和1個(gè)小的結(jié)構(gòu)域，整體二級(jí)結(jié)構(gòu)相似度很高（圖1）[21-24]。L-TAs單體大結(jié)構(gòu)域?yàn)棣?β/α三明治折疊模式，共包含7個(gè)β折疊，大結(jié)構(gòu)域位于四聚體中間位置，PLP的醛基共價(jià)結(jié)合于大結(jié)構(gòu)域的特定賴氨酸殘基；L-TAs的小結(jié)構(gòu)域通常由2～4個(gè)β折疊和α螺旋構(gòu)成，位于四聚體的外圍。2個(gè)單體緊密接觸形成催化二聚體，活性位點(diǎn)位于2個(gè)單體緊密接觸的界面處，每個(gè)催化二聚體含有2個(gè)活性中心，共有4個(gè)活性中心。L-TAs的活性中心具有極其相似的保守氨基酸殘基和高度相似的空間結(jié)構(gòu)，PLP的功能基團(tuán)與這些保守的氨基酸殘基形成特定的相互作用（圖1C）。

L-TAe（大腸桿菌）的活性中心，PLP與Lys197共價(jià)結(jié)合形成內(nèi)部醛亞胺，但在pH5.6條件下PLP與Lys197無法形成內(nèi)部醛亞胺[22]。PLP的吡啶環(huán)與His83的咪唑環(huán)形成π堆疊，與Ala168形成疏水接觸；吡啶環(huán)的氮原子與Asp166的羧基形成氫鍵相互作用，酚羥基與Arg169的胍基形成氫鍵相互作用，磷酸基團(tuán)直接與Arg229的胍基相互作用?；钚灾行暮?個(gè)重要的水分子，一個(gè)水分子與PLP的磷酸基團(tuán)，Ser196、Ser205的羥基，Gly204的酰胺氧形成氫鍵相互作用；另外一個(gè)水分子介導(dǎo)了PLP磷酸基團(tuán)與Gly227和Lys222形成氫鍵相互作用[21]。L-TAe可結(jié)合6個(gè)鎂離子或鈣離子，其中4個(gè)二價(jià)陽離子距離活性中心9 ?，另外2個(gè)位于四聚體對(duì)稱中心。

L-TAaj（簡氏氣單胞菌 DK-39）的 Arg171、Arg313、Ser8的側(cè)鏈與醛亞胺相互作用，將底物錨定到活性位點(diǎn)，His85的咪唑環(huán)與PLP-GLY的吡啶環(huán)形成π堆疊，并且可參與調(diào)節(jié)蘇氨酸醛縮酶的立體特異性。配體Gly的氨基略微偏離PLPGly的吡啶環(huán)平面，使其易斷裂的外部醛亞胺鍵垂直于PLP-Gly的吡啶環(huán)平面。His128的側(cè)鏈可與底物L(fēng)-allo-Thr上的羥基形成氫鍵，當(dāng)His128突變?yōu)門yr時(shí)，殘基的側(cè)鏈從活性位點(diǎn)移出4.2 ?。與野生型酶相比，L-Taj的H128Y/S292R突變體對(duì)L-allo-Thr的活性提高了3倍，對(duì)LThr的活性提高了322倍。

圖1 L-TAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)與活性中心

L-TAtm（海棲熱袍菌）與L-TAaj具有相似的整體結(jié)構(gòu)，用DALI服務(wù)器（Holm&Sander，1995）進(jìn)行結(jié)構(gòu)比較，L-TAaj與L-TAtm的晶體結(jié)構(gòu)有49%的一致性（Z-score 47.9；r.m.s.d.1.2 ?）[23]。L-TAtm含有鈣離子和鈉離子，鈣離子位于每個(gè)單體的大小結(jié)構(gòu)域之間，四聚體包含6個(gè)鈣離子，有2個(gè)位于四聚體對(duì)稱中心，每個(gè)鈣離子通常含有1到2個(gè)水分子；鈉離子位于Arg72，含有2個(gè)水分子。金屬離子可能具有穩(wěn)定四聚體的作用。

2.2 D-TA的結(jié)構(gòu)

D-TAax（木糖氧化產(chǎn)堿菌）為同源二聚體，2個(gè)單體頭尾相連，接觸面共同組成2個(gè)活性中心（圖2）[25]。每個(gè)單體含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，大的結(jié)構(gòu)域由8條α/β-桶狀結(jié)構(gòu)組成的丙氨酸消旋酶樣結(jié)構(gòu)域（32～274殘基），小結(jié)構(gòu)域由N端（1～31殘基）和C端（275～379殘基）組成的β-結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。β-結(jié)構(gòu)域包含5個(gè)反相平行的β鏈組成的β桶裝蛋白（275～347殘基）和3個(gè)β鏈組成的β片層?；钚灾行牡妮o酶PLP與大結(jié)構(gòu)域保守的Lys59可共價(jià)結(jié)合，PLP 的吡啶環(huán)與 Tyr187（～3.7 ?）形成π堆疊。PLP的其余基團(tuán)主要通過形成氫鍵與酶結(jié)合：PLP的吡啶環(huán)的氮原子與Gln249形成氫鍵；PLP的磷酸基團(tuán)與Thr233、Ser252和Tyr260的羥基，與Thr233和Gly251的氨基形成氫鍵；PLP的吡啶環(huán)的羥基與Gln81的側(cè)鏈氨基及Arg157的胍基形成氫鍵。

D-TAax的催化活性中心含有二價(jià)錳離子。錳離子與PLP的醛基相距5距離吡啶環(huán)共軛面 0.4 ?，距 離 His347 的 Nε 原 子 2.2 ?，距 離Asp349的羧基2.2 ?。錳離子與4個(gè)水分子配位（1.8～2.3 ?）形成一個(gè)扭曲的八面體，作為路易斯酸參與D-TAax的催化過程，對(duì)D-TA的立體選擇性具有重要作用[25]。

圖2 D-TA的結(jié)構(gòu)與活性中心

3 TAs的催化機(jī)制

3.1 輔酶PLP介導(dǎo)的催化循環(huán)

TAs處于非催化狀態(tài)時(shí)，PLP與活性中心特定的賴氨酸殘基形成席夫堿（內(nèi)部醛亞胺）。含有氨基的底物（Gly、β-羥基-α-氨基酸）進(jìn)入活性中心，從內(nèi)部醛亞胺中置換賴氨酸的ε-氨基，與PLP形成新的席夫堿（外部醛亞胺）[14]。外部醛亞胺是TAs催化發(fā)生羥醛縮合和逆向羥醛裂解的共同中間體，Gly是所有TAs通用的α-氨基酸供體[9]。在羥醛縮合過程中，Gly與PLP形成外部醛亞胺PLP-Gly，吡啶環(huán)幫助α-碳的質(zhì)子轉(zhuǎn)移至酶催化中心的廣義堿，產(chǎn)生高度共振的陰離子；醛受體進(jìn)攻α-碳形成C-C鍵，產(chǎn)物通過席夫堿交換機(jī)制被釋放出活性中心，PLP則從產(chǎn)物轉(zhuǎn)移回到活性中心的保守賴氨酸的側(cè)鏈重新形成內(nèi)部醛亞胺，完成一個(gè)催化循環(huán)。逆向羥醛裂解過程是由外部醛亞胺βC位的羥基去質(zhì)子化開始，接著進(jìn)行C-C鍵的斷裂，最終被裂解為醛和Gly[8,20,22,25]。

3.2 TAs的立體選擇性機(jī)制

Uhl等[25]比較了D-TAax和L-TAtm的活性中心，發(fā)現(xiàn)活性中心的位點(diǎn)近似鏡像對(duì)稱[25]，可以理解為L-TAtm的活性中心的入口位于PLP吡啶環(huán)的si面（si-face），D-TAax的活性中心入口位于PLP的re面（re-face）（圖3）。因此，當(dāng)Gly供體與PLP形成外部醛亞胺后，醛受體只能從輔酶PLP吡啶環(huán)的si面進(jìn)攻α-碳，從而嚴(yán)格地控制L-TAs對(duì)α-碳的立體選擇性。D-TAs與L-TAs恰好相反的是，醛受體只能從輔酶PLP吡啶環(huán)的re面進(jìn)攻外部醛亞胺的α-碳，也能非常嚴(yán)格地控制DTAs對(duì)α-碳的立體選擇性。

圖3 L-TA與D-TA的PLP結(jié)合構(gòu)象呈鏡面對(duì)稱

Fesko等[14]進(jìn)行了一項(xiàng)核磁共振研究，以了解為何L-TAs催化產(chǎn)物β-碳位的快速差向異構(gòu)化而D-TAs沒有進(jìn)行快速差向異構(gòu)化的化學(xué)機(jī)制?；赑LP介導(dǎo)的TAs催化循環(huán)機(jī)理，可以推導(dǎo)出酶促反應(yīng)過程中產(chǎn)生的中間體（外部醛亞胺PLP-Gly）和底物（Gly、醛受體），將甘氨酸、苯甲醛、酶，以及13C標(biāo)記的順式產(chǎn)物（syn）與未標(biāo)記的反式（anti）產(chǎn)物以60∶40的比例混合，測(cè)定從順式產(chǎn)物到反式產(chǎn)物和游離Gly的13C標(biāo)記轉(zhuǎn)移的相對(duì)速率。在動(dòng)力學(xué)控制反應(yīng)中，L-TA具有中等選擇性，D-TA具有高的選擇性，順式產(chǎn)物為主要部分，而對(duì)于L-allo-TA和L-low-TA的產(chǎn)物主要為反式產(chǎn)物。在熱力學(xué)控制下，對(duì)于所有TAs，得到60/40（syn/anti，d.e.≈20%）的比例。L-TA的限速步驟是甘氨酸與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合形成Gly-PLP復(fù)合物，以及α-碳去質(zhì)子化的過程，需要較高的活化能。D-TAs的限速步驟是C-C鍵的形成，在動(dòng)力學(xué)控制下D-TA可以獲得高非對(duì)映選擇性產(chǎn)物（d.e.＞95%，syn）[14]。

4 TAs的定向進(jìn)化

天然的L-TAs無法滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。酶的定向進(jìn)化是提高酶的催化效率、立體選擇性、熱穩(wěn)定性的有效手段。目前，L-TAs定向進(jìn)化策略主要包括兩類，一類是利用L-TAs基因缺陷型工程菌直接進(jìn)行篩選[20]，一類是通過檢測(cè)L-TAs的催化裂解產(chǎn)物乙醛或芳香乙醛進(jìn)行篩選[26]。

基因工程改造大腸桿菌使其Gly營養(yǎng)缺陷，含有外源L-TAs基因的陽性克隆可以裂解手性底物產(chǎn)生Gly來維持正常生長，這種方法可用于以Gly為供體的催化反應(yīng)[27]。利用惡臭假單胞菌KT2440可以苯甲醛作為碳源進(jìn)行生長的特點(diǎn)，首先使其失去內(nèi)源性的TAs，通過質(zhì)粒導(dǎo)入待篩選的TAs基因。陽性克隆以手性苯基絲氨酸作為底物，產(chǎn)生可供其利用的苯甲醛，維持正常增殖[20]，這種方法適用于篩選以芳香醛為醛受體的催化反應(yīng)。TAs裂解目標(biāo)底物產(chǎn)生乙醛或芳香醛，利用乙醛脫氫酶（ALDH）在乙醛存在條件下還原NADH，直接測(cè)定340 nm波長下的光密度變化間接檢測(cè)TAs的催化活性[28]。采用乙酰丙酮分光光度法測(cè)定乙醛，也適用于高通量篩選[26]。

Baik等對(duì)來源于天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）的L-low-TA進(jìn)行定向進(jìn)化，使其催化合成L-threo-DOPS（屈昔多巴）的d.e.值從14%（syn）提升到55%（syn）[29]。第1輪篩選采用自動(dòng)化的克隆篩選系統(tǒng)（QARRAY lite，X2601，Genetix），挑選了25 000個(gè)克隆，在深孔板中培養(yǎng)后，以L-蘇氨酸為底物，利用乙酰丙酮分光光度法檢測(cè)裂解產(chǎn)物乙醛進(jìn)行高通量篩選。4個(gè)突變體T2-2（V86I/R241C/Y306C）、T2-4（Y34C）、T3-2（R241C/A287V）和T3-3（Y39C，Y306C）的催化活性和立體選擇性均較好，非對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)物的d.e.分別為21%（syn）、26%（syn）、21%（syn）和38%（syn）。采用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)T3-3進(jìn)行隨機(jī)突變，在20 000個(gè)克隆中獲得2個(gè)立體選擇性較高的突變體T3-3m5（Y39C/Y306C/A48T）和 T3-3m7（Y39C，Y306C，R316C），非對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)物的d.e.分別為43%（syn）和28%（syn）。通過2輪篩選發(fā)現(xiàn)突變體 T3-3（Y39C，Y306C）、T3-3m5（Y39C/Y306C/A48T）、T3-3m7（Y39C，Y306C，R316C）均含有Y39C和Y306C突變，推測(cè)Y39C和Y306C對(duì)提高立體選擇性具有重要貢獻(xiàn)。把T2-4（Y34C）的突變分別引入T3-3、T3-3m5、T3-3m7中，獲得新的突變體T3-3mm1、T3-3mm2、T3-3mm3，產(chǎn)物的d.e.分別為52%、55.4%和49%。突變體T3-3mm2以L-threo-DOPS為底物的特異性常數(shù)比值為1.8×107，與野生型的特異性常數(shù)比值1.1×108相近[17,26,29]。

5 TAs在生物催化合成中的應(yīng)用

β-羥基氨基酰胺酒石酸是重要的候選藥物，其關(guān)鍵中間體（2R，3S）-2-amino-3-hydroxy-3-pyridin-4-yl）-propanoic acid的化學(xué)合成須多步反應(yīng)，且起始物料異腈基乙酸乙酯不穩(wěn)定、有毒，產(chǎn)物為消旋體[30]。采用D-TAax（木糖氧化產(chǎn)堿菌IFO12699）和 D-TAar（節(jié)桿菌DK-38）的催化工藝不僅實(shí)現(xiàn)了工藝簡化，還降低了成本。二價(jià)金屬離子鈷離子或鎳離子可維持重組D-TAax和DTAar在4℃條件下1周內(nèi)保持酶活性不變。通過工藝優(yōu)化，從小試放大到100 L體系，獲得的產(chǎn)物均具有很高的d.e.（99.1%，syn）[31]。

L-TAs可以直接催化合成氯霉素的中間體L-4-硝基苯基絲氨酸[16]。余進(jìn)海等[18]研究了大腸桿菌蘇氨酸醛縮酶催化合成L-4-硝基苯基絲氨酸的工藝，重點(diǎn)考察了溫度、pH、底物濃度、底物比例、反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化合成的影響。在45℃、pH8.0、甘氨酸濃度500 mmol/L、對(duì)硝基苯甲醛濃度100 mmol/L的條件下，反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化率為43%，順式產(chǎn)物與反式產(chǎn)物的比例為2∶1。

L-threo-DOPS為去甲腎上腺素的前體分子，是一種已上市的帕金森癥治療藥物。Gwon等以大腸桿菌JM109為宿主菌表達(dá)篩選突變體T3-3mm3（Y34C/Y39C/Y306C/R316C），含有該酶的菌體在-80℃冷凍過夜后直接用于催化合成L-threo-DOPS，在最優(yōu)催化條件（2 mol/L甘氨酸，145 mmol/L 3，4-dihydroxybenzaldehyde，0.6 g/L PLP，50 mmol/L亞硫酸鈉，0.0075 g/L Triton X-100，pH6.5）下，產(chǎn)物的d.e.（60%，syn）相比優(yōu)化前的d.e.（49%，syn）提高了11%[29]。

6 TAs研究展望

D-TA通過工藝優(yōu)化和動(dòng)力學(xué)控制，可以很好地控制β-碳位的立體選擇性，已成功應(yīng)用于β-羥基氨基酰胺酒石酸的合成。L-TAs還需要進(jìn)一步的催化機(jī)制研究和酶工程改造。通過解析L-TAs與不同立體構(gòu)型的目標(biāo)產(chǎn)物或醛受體的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，有望找到其對(duì)β-碳手性控制的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。在結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可以采用基因突變、計(jì)算機(jī)模擬（分子動(dòng)力學(xué)、QM/MM等）等研究L-TAs的手性控制機(jī)制，尋找潛在的手性控制方法。通過酶工程降低PLP-Gly形成的活化能，亦有望增加L-TAs催化反應(yīng)的立體選擇性。定向進(jìn)化可以提高TAs的非對(duì)映選擇性。需要注意的是，在篩選和測(cè)試酶活性的策略上，以通用底物蘇氨酸為基礎(chǔ)的簡單活性測(cè)試方法可能與具體應(yīng)用存在較大差異。很有必要直接以目標(biāo)來建立高通量篩選方法。

開發(fā)以L-TAs為生物催化劑的新工藝來生產(chǎn)氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、腎上腺素、屈昔多巴等原料藥的關(guān)鍵技術(shù)，不僅有望提高此類原料藥的品質(zhì)，降低合成工藝復(fù)雜度，還可以降低生產(chǎn)成本、減少環(huán)境污染。