HPLC法同時(shí)測定補(bǔ)腎溫肺合劑中6種活性成分含量

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(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012)

補(bǔ)腎溫肺合劑是湖南省直中醫(yī)院(我校附屬第一醫(yī)院)的院內(nèi)制劑，由淫羊藿、五味子、山茱萸、防風(fēng)、白術(shù)等十味中藥組成，具有補(bǔ)腎溫肺、固表化飲之功效，臨床上用于過敏性鼻炎、哮喘、慢性支氣管炎等疾病的治療。目前該制劑在質(zhì)量控制上僅為薄層色譜法的定性鑒別和淫羊藿中淫羊藿苷的含量測定，制劑中其他主要有效成分含量測定的方法尚未見報(bào)道。為了更有效地控制該制劑的質(zhì)量，本文建立了一種同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲6種主要活性成分含量的方法，為補(bǔ)腎溫肺合劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC-20AT泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、島津LC-solution色譜數(shù)據(jù)工作站；KQ5200DA超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

對照品莫諾苷(批號25406-64-8)、馬錢苷(批號18524-94-2)、升麻素苷(批號80681-45-4)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號84272-85-5)、淫羊藿苷(批號489-32-7)、五味子醇甲(批號7432-28-2)，所有對照品純度均大于98%，均購自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。補(bǔ)腎溫肺合劑(100 mL/瓶，批準(zhǔn)文號：湘藥制字Z20070353，批號171010、171206、180320)。甲醇為色譜醇，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的對照品適量，加甲醇溶解并定容于20 mL量瓶中，搖勻，制成含莫諾苷0.33 mg·mL-1、馬錢苷0.26 mg·mL-1、升麻素苷0.39mg·mL-1、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.29 mg·mL-1、淫羊藿苷0.25 mg·mL-1、五味子醇甲0.25 mg·mL-1的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密量取補(bǔ)腎溫肺合劑1 mL，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理5 min，加50%甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，置于陰涼處保存。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方分別制備缺少淫羊藿、五味子、山茱萸、防風(fēng)的陰性樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

Phenomenex luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，線性梯度洗脫(0～20 min，45%A；20～21 min，45%A→65%A；21～30 min，65%A；30～35min，65%A→67%A)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長240 nm(莫諾苷和馬錢苷)、250 nm(五味子醇甲)、254 nm(升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷)和270 nm(淫羊藿苷)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，混合對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于5mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的混合對照品溶液。取上述不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的回歸方程，見表1。

1.莫諾苷(morroniside)；2.馬錢苷(loganin)；3.升麻素苷(Prim-o-glucosylcimifugin)；4.5-O-甲基維斯阿米醇苷(5-O-methylvisammioside)；5.五味子醇甲(icariin)；6.淫羊藿苷(schisandrin)

圖1混合對照品(A)、樣品(B)、不含山茱萸的陰性樣品(C)、不含防風(fēng)的陰性樣品(D)和不含淫羊藿的陰性樣品(E)和不含五味子的陰性樣品(F)色譜(254nm)

2.4 精密度試驗(yàn)

取上述6種組分的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的RSD分別為1.2%、1.1%、0.96%、1.3%、0.92%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24h進(jìn)樣測定，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲峰面積的RSD分別為1.1%、0.95%、1.2%、1.5%、0.97%、1.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 6個(gè)成分的線性回歸方程

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.1.2”項(xiàng)下條件平行制備供試品溶液6份，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲含量平均值(n=6)分別為2.29、1.13、2.85、0.46、0.32、0.18 mg·mL-1，RSD分別為1.3%、0.95%、0.98%、1.1%、0.99%、1.2%。表明方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率

精密量取“2.6”項(xiàng)下已測知6種成分準(zhǔn)確含量的補(bǔ)腎溫肺合劑樣品0.6 mL，共9份，再分別精密加入相當(dāng)于含量120%、100%、80%的莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲對照品溶液，分別制備得到高、中、低不同濃度的供試溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.8 樣品含量測定

取3個(gè)批次的補(bǔ)腎溫肺合劑，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定6種成分含量。結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

表3 補(bǔ)腎溫肺合劑中6種成分含量 (mg·mL-1，n=3)

3 討論

3.1 質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)的選擇

補(bǔ)腎溫肺合劑中淫羊藿為君藥，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效。淫羊藿中的單體化合物以淫羊藿苷含量最高，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)神經(jīng)突觸生長等活性[1]?！吨袊幍洹?2015版)將淫羊藿苷作為淫羊藿質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[2]。五味子也為補(bǔ)腎溫肺合劑中的君藥，具有益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效。五味子醇甲是五味子的主要活性成分，具有抑制腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌、保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞等作用[3]?！吨袊幍洹?2015版)將五味子醇甲作為五味子質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[2]。山茱萸和防風(fēng)均為補(bǔ)腎溫肺合劑中的臣藥。其中，山茱萸具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫之功效，莫諾苷和馬錢苷作為山茱萸的主要活性成分，具有抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎、抗血栓等藥理作用[4]。2015版《中國藥典》將二者作為山茱萸質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[2]。防風(fēng)具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛之功效，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷是防風(fēng)中含量較高的活性成分，具有止痛、抗炎、解熱等藥理作用[5]。2015版《中國藥典》將二者作為防風(fēng)質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[2]。因此，本文選擇莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲作為補(bǔ)腎溫肺合劑的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，本實(shí)驗(yàn)首先考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水等不同溶劑系統(tǒng)，結(jié)果顯示甲醇-0.1%甲酸水溶液作為洗脫劑可以實(shí)現(xiàn)幾種成分的較好分離，且峰形良好。其次，考察了不同的酸(甲酸、磷酸)對分析結(jié)果的影響，結(jié)果顯示2種酸對分析結(jié)果并無明顯影響。在考察酸體積分?jǐn)?shù)(0.02%，0.05%，0.1%，0.2%)時(shí)，當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.1%或0.2%時(shí)，色譜峰的峰形良好，但是當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)低于0.1%以下時(shí)，5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰寬變大。因此，最后流動(dòng)相條件確定為甲醇-0.1%甲酸水溶液。

3.3 檢測波長的選擇

紫外掃描顯示，莫諾苷、馬錢苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的最大吸收波長分別為240 nm、236 nm、254 nm、254 nm、270 nm和251 nm，參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]及《中國藥典》(2015版)一部“山茱萸”“防風(fēng)”“淫羊藿”“五味子”項(xiàng)下指標(biāo)成分含量測定波長，確定莫諾苷和馬錢苷的檢測波長為240 nm，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的檢測波長為254 nm，淫羊藿苷檢測波長為270 nm，五味子醇甲的檢測波長為250 nm。