斷裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白純化系統(tǒng)的構(gòu)建

王玉君，王姝婧，杜夜星，馮利利，夏海鋒*，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

內(nèi)含肽是存在于未成熟前體蛋白中的一段多肽鏈，在前體蛋白轉(zhuǎn)化為成熟蛋白質(zhì)的過程中，依靠自我催化從前體蛋白中釋放出來，同時將兩端的蛋白質(zhì)外顯肽通過肽鍵連接，該過程稱為蛋白質(zhì)剪接[1-3]。內(nèi)含肽利用自身高效的蛋白反式剪接作用，能夠在目標蛋白有效純化的同時去除純化標簽，在蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域得到了廣泛的研究和關(guān)注。

來源于Nostoc punctiforme PCC73102 菌株的Npu DnaE 天然斷裂內(nèi)含肽具有很高的剪接活性和斷裂活性，其剪接活性可以達到98 %以上[4]。它的N端和C 端剪接區(qū)域分別含有102 個和36 個氨基酸且中間無歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。此外，與高度同源的Ssp DnaE 天然斷裂內(nèi)含肽相比，Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽更加能夠容忍C 末端外顯肽替換并且擁有更加快速的剪接速率[5]。與其它類型的內(nèi)含肽相比，Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽更加的適合生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。改造過的Npu DnaE-C 端剪切型蛋白純化系統(tǒng)在還原劑DTT 的誘導(dǎo)下能實現(xiàn)快速剪切，室溫下30 s 內(nèi)的剪切效率達到50%，半小時內(nèi)可以完成90%以上外源蛋白的釋放[6-7]。Ramirez[6]等利用Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽成功的純化到磷酸脫氫酶（PTDH）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）等不同結(jié)構(gòu)的蛋白，充分的說明了內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白純化系統(tǒng)可以廣泛的應(yīng)用到不同目標蛋白的分離純化過程中去。但由于層析標簽（比如麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）、甲殼素結(jié)合蛋白（CBD））和層析介質(zhì)之間相對較弱的結(jié)合力，許多親和配基片段易從層析介質(zhì)上脫落，造成了目的蛋白的污染[7]。

基于Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽的優(yōu)良剪接性能以及在蛋白質(zhì)表達和純化中的應(yīng)用潛力和技術(shù)需求，本文設(shè)計了一種Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達與親和純化系統(tǒng)，主要包括IN親和配基片段及IC融合蛋白片段。通過改變IN和IC片段的結(jié)構(gòu)以及利用Zn2+對斷裂速率的抑制，從中選擇出與層析過程契合度最好的組合及斷裂條件。利用Cys 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的親和標簽和層析介質(zhì)進行偶聯(lián)，成功的制備了IN親和層析介質(zhì)，并將其應(yīng)用到綠色熒光蛋白（GFP）的純化。對于調(diào)整內(nèi)含肽的剪切活性，控制剪切速率，有著重要的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自生工生物（上海）工程技術(shù)有限公司；引物由生工生物（上海）工程技術(shù)有限公司合成；Ni-NTA 親和層析介質(zhì)和Purose 6 Fast Flow 空白層析介質(zhì)，江蘇千純生物科技有限公司；含有內(nèi)含肽Npu DnaE 基因序列的質(zhì)粒pRSFDuet-NpuDnaE，由美國俄亥俄州立大學(xué)化工系David W.Wood 教授課題組提供；表達質(zhì)粒pET-28a、pET-21b 和pET24b 由本實驗室保存；質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達用菌株E.coli JM109 和E.coli BL21（DE3）由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 IN親和配基片段重組菌株構(gòu)建 設(shè)計IN以組氨酸標簽為純化標簽，并利用此標簽不同位置所形成的空間位阻，考察IN和IC片段斷裂性質(zhì)的影響。利用pET-28a 和pET-21b 表達載體在多克隆位點結(jié)構(gòu)上的差異以及組氨酸標簽位置的不同，以Nde I 和Hind III 兩個酶切位點進行3 種親和配基片段構(gòu)建。其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1 所示。主要包括以下幾個方面的改造：1）采用基因定點突變的方法將IN 首位的氨基酸Cys 突變?yōu)锳la，阻斷N 端斷裂反應(yīng)的進行[8-9]；2）在IN的C 末端添加Cys，利用其上面的巰基和活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)上的環(huán)氧乙烷基團反應(yīng)進行共價偶聯(lián)[10]；3）通過組氨酸標簽在IN片段中的位置不同（在IN的N 端或者C 端）以及組氨酸標簽和IN片段之間多余氨基酸片段的添加構(gòu)建了3 種不同結(jié)構(gòu)的IN親和配基片段。

圖1 親和配基片段的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of affinity ligand

以pRSFDuet-NpuDnaE 質(zhì)粒為模板，分別加入引物S′IN-1/A′IN-1、S′IN-2/A′IN-2 和S′IN-3/A′IN-3進行PCR 擴增，構(gòu)建3 種不同的IN片段（N1，N2，N3）。本文中所使用的引物如表1 所示。將PCR 擴增得到的序列分別于pMD19（Simple）-T 載體進行連接，涂布相應(yīng)抗性的平板，篩選陽性克隆子，酶切和測序驗證。利用Nde I 和Hind III 限制性核酸內(nèi)切酶將N1 與pET-28a 載體進行連接，N2、N3 片段分別與pET-21b 載體進行連接。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a-N1 及pET-21b-（N2，N3）轉(zhuǎn) 入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，得到重組表達菌株E.coli BL21（DE3）/pET-28a-N1 和E.coli BL21（DE3）/pET-21b-（N2，N3），-80 ℃超低溫下甘油管保藏。

表1 本文中所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 IC融合蛋白片段重組菌株構(gòu)建 同理利用pET-28a 和pET-24b 表達載體的不同，以Nde I 和Hind III 兩個酶切位點進行2 種IC融合蛋白片段構(gòu)建。以Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽的C 片段為基礎(chǔ)進行IC融合蛋白片段的改造，主要包括以下幾個方面：1）采用基因定點突變的方法引入D118G 突變。該突變可以解除C 端斷裂對N 端斷裂的依賴，提高C 端斷裂速率[6]；2）通過融合PCR 的方式將IC片段和GFP連接，并在IC片段末端連接了3 個氨基酸Cys-Phe-Asn（CFN）來提供C 端斷裂過程中的關(guān)鍵氨基酸+1Cys[11-12]；3）將IC-GFP 片段分別與表達載體pET-28a 與pET-24b 連接，構(gòu)建兩種不同結(jié)構(gòu)的融合蛋白片段。其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2 所示，分別命名為CG1（H-C-GFP）和CG2（C-GFP-H）。

圖2 融合蛋白片段的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of IC-GFP fusion protein fragment

以pRSFDuet-NpuDnaE 質(zhì)粒為模板，加入引物S′D118G/A′D118G 對IC片段進行基因定點突變。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli JM109 感受態(tài)細胞中，測序驗證后，-80 ℃低溫保存。

分別以D118G 突變后的質(zhì)粒以及含有GFP 片段的質(zhì)粒pEGFP-N1 為模板，利用引物F1/R1和F1/R1進行IC和GFP 片段的擴增。將兩片段按照等摩爾濃度進行混合，用PrimeSTAR DNA 聚合酶進行擴增。最后以F1/R2為引物，使用Ex Taq DNA 聚合酶對融合后的片段進行PCR 擴增。凝膠回收融合后的IC-GFP 片段，與pMD19（Simple）-T 載體進行連接，得到pMD-19T-IC-GFP 重組質(zhì)粒。

將酶切后的IC-GFP 片段分別與酶切后的pET-28a 和pET-24b 載體進行連接，得到重組質(zhì)粒pET-28a-CG1 及pET-24b-CG2。最后轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，得到重組表達菌株E.coli BL21（DE3）/pET-28a-CG1 及E.coli BL21（DE3）/pET-24b-CG2，-80 ℃超低溫下甘油管保藏。

1.2.3 蛋白表達與純化 取已構(gòu)建的甘油管保藏的菌株于LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)活化。按照1%的接種量接種到新鮮的TB 培養(yǎng)基（含有相應(yīng)的抗生素）中至菌體濃度（OD600）達到0.8 時，加入50 mmol/L的IPTG 儲存液至終濃度為1 mmol/L[13]。在16 ℃，180 r/min 的條件下誘導(dǎo)蛋白表達20 h，離心收集表達后的菌體細胞，于-80 ℃冰箱中待用。

將收集到的菌體按照細胞濕重10%（w/v）的量加入結(jié)合緩沖液Buffer A（50 mmol/L 磷酸鈉；0.5 mol/L 氯化鈉；100 mmol/L 咪唑；pH 8.0）重懸，冰浴條件下超聲裂解細胞。將破碎的細胞裂解液離心（12 000 g×30 min）收集上清并用0.22 μm 的濾膜過濾。使用?KTA 蛋白純化儀將細胞上清液上樣到Ni-NTA 親和層析柱中，用20 mmol/L 咪唑濃度的結(jié)合緩沖液清洗未結(jié)合的雜蛋白；用洗脫緩沖液Buffer B（50 mmol/L 磷酸鈉；0.5 mol/L 氯化鈉；500 mmol/L 咪唑；pH 8.0）洗脫目的蛋白。純化后的目的蛋白通過3 000 kDa（N1、N2、N3）和10 kDa（CG1、CG2）的超濾膜進行超濾濃縮和緩沖液的更換。

1.2.4 柱外斷裂實驗 通過超濾管將純化后的目的蛋白中的緩沖液更換成Buffer C（50 mmol/L 磷酸鈉；0.5 mol/L 氯化鈉；pH 8.0）。采用考馬斯亮藍法[14]測定各片段的濃度，按照摩爾比為3∶1（IN∶IC）的比例取相應(yīng)體積的IN 片段（N1、N2、N3）于1.5 mL 的EP 管中，加入終濃度為50 mmol/L 的二硫蘇糖醇（DTT）。取相應(yīng)體積的CG（CG1、CG2）片段加入反應(yīng)體系中混勻，開始斷裂反應(yīng)。該反應(yīng)在室溫下進行，在不同時間點取樣進行SDS-PAGE 電泳檢測。利用IamgeJ 軟件掃描SDS-PAGE 圖片上的相應(yīng)目標條帶的濃度，根據(jù)相對分子質(zhì)量計算相應(yīng)條帶的摩爾濃度，按照文獻[8]的方法計算斷裂效率。

1.2.5 Zn2+的抑制作用 本文研究了不同濃度的Zn2+對斷裂反應(yīng)的抑制效果。由于Zn2+在堿性環(huán)境中容易發(fā)生沉淀，在研究Zn2+對斷裂反應(yīng)的抑制作用的過程中將目標蛋白的環(huán)境條件更換為Buffer C（x mmol/L Zn2+；0.5 mol/L NaCl；50 mmol/L Na2HPO4；pH 6.0）。在Buffer C 中將Zn2+的濃度分別設(shè)定為x=0，0.5，1，1.5，2，5。

按照N 片段與CG 片段摩爾比為3∶1 的比例稱取適量的蛋白凍干粉，用不同Zn2+濃度的Buffer C緩沖液溶解。在室溫下進行斷裂反應(yīng)，并在反應(yīng)的不同時間分別取樣，進行SDS-PAGE 檢測和分析。

1.2.6 IN層析介質(zhì)的偶聯(lián) 采用Buffer D（0.1mol/L Na2CO3/NaHCO3，pH 10.0）溶解親和配基片段N3，配置成濃度為7 mg/mL 的蛋白溶液。稱取5 g 環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)于帶塞的25 mL 三角瓶中，加入15 mL 的N3 蛋白溶液進行偶聯(lián)反應(yīng)。偶聯(lián)條件為：40 ℃，150 r/min，16 h。偶聯(lián)后的介質(zhì)用大量的去離子水清洗并抽干，20 %乙醇溶液中，4 ℃保存。

1.2.7 IN親和層析介質(zhì)對融合蛋白表達片段CG2的純化 將制備好的親和層析介質(zhì)裝于1 mL 的預(yù)裝柱中，采用?KTA purifier 層析系統(tǒng)進行整個蛋白純化過程，流速控制在1 mL/min。其親和純化過程如圖3 所示，具體操作如下所示：

1）介質(zhì)平衡與上樣。用10 倍柱體積的平衡緩沖 液Buffer E（1 mmol/L Zn2+；0.5 mol/L NaCl；50 mmol/L 磷酸鈉；pH 6.0）對介質(zhì)進行充分平衡，以1 mL/min 的流速將CG 粗蛋白液上樣1 mL。

2）清洗雜蛋白。用5 倍柱體積的平衡緩沖液充分沖洗，除去未結(jié)合的蛋白。最后用2 倍體積不含Zn2+的平衡緩沖液沖洗，除去介質(zhì)內(nèi)的Zn2+。

3）誘導(dǎo)斷裂。3 倍體積斷裂緩沖液Buffer F（50 mmol/L DTT，20 mmol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L 磷酸鈉，pH 8.0）沖洗層析介質(zhì)。室溫下靜置10 min。

5）洗脫。用洗脫緩沖液Buffer C（50 mmol/L 磷酸鈉；0.5 mol/L 氯化鈉；pH 8.0）洗下斷裂后的GFP并進行收集。

6）親和層析介質(zhì)的再生。用再生緩沖液Buffer G（10 mmol/L Tris-HCl；0.5 mol/L NaCl；6 mol/L 鹽酸胍，pH 8.0）將與親和介質(zhì)結(jié)合的IC 以及未完全斷裂的CG2 片段洗脫下來。

圖3 IN親和層析介質(zhì)的親和純化過程Fig.3 Purification process of INaffinity chromatography

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的構(gòu)建

以pRSFDuet-NpuDnaE 和pEGFP-N1 質(zhì)粒為模板，利用分子生物學(xué)手段成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-N1、pET-21b-（N2，N3）、pET-28a-CG1和pET-24b-CG2。重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果表明（圖4）：在300 bp 與400 bp 相對應(yīng)的位置出現(xiàn)目的基因條帶，證明N1、N2、N3 片段與表達載體正確連接；在800 bp 與1 000 bp 之間也有相應(yīng)的CG 基因片段的目標條帶出現(xiàn)。所有的質(zhì)粒都經(jīng)過基因測序進一步證明序列的正確性。

2.2 蛋白表達和純化

接種構(gòu)建好的重組表達菌株于新鮮的TB 培養(yǎng)基中進行親和配基片段和融合蛋白片段的表達。在IPTG 的誘導(dǎo)下，3 種N 片段和兩種CG 片段都成功的進行了表達，表達比較高。（圖5）

為了研究N 與CG 片段在柱外斷裂情況，需要對這五種蛋白片段進行分離純化。本實驗中利用N與CG 片段中帶有的His 標簽對其進行Ni 親和純化。結(jié)果表明，3 種N 片段及CG1 與CG2 片段都得到了較好的純化效果。穿透液中有少量的目標蛋白存在，這可能是目標蛋白在表達過程中組氨酸標簽沒有暴露導(dǎo)致無法與Ni-NTA 層析介質(zhì)結(jié)合[15]。通過后續(xù)進一步優(yōu)化蛋白表達條件可以避免這種現(xiàn)象的產(chǎn)生。

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切驗證圖Fig.4 Digestion of recombinant plasmids with Nde I and Hind III

圖5 純化電泳圖Fig.5 SDS-PAGE results of the purification

2.3 體外斷裂實驗

將3 種N 片段和兩種CG 片段兩兩組合，共形成6 種不同的斷裂反應(yīng)組合，分別命名為A、B、C、D、E、F。各個組合斷裂結(jié)果如圖6 所示。通過分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)不同的N 和CG 片段相互作用時，其斷裂速率各不相同，呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。其中，組合F 的斷裂速率最快，小于1 min 的時間內(nèi)就可以達到90%以上的斷裂速率。而文獻[7]構(gòu)建的純化體系為了達到相同的斷裂速率需要花費30 min 以上的時間?？赡苁且驗镃ys 替代CBD 標簽在三維空間結(jié)構(gòu)上減少了兩片段之間結(jié)合阻力，加速斷裂反應(yīng)的進行。為了更直觀的比較不同組合斷裂時所需要的時間，本文將6 中不同組合的斷裂速率總結(jié)成表2。

圖6 6種組合斷裂過程不同時間點取樣SDS-PAGE 結(jié)果圖Fig.6 SDS-PAGE of the C-cleavage reaction between six different groups of N and CG

表2 六種組合斷裂反應(yīng)活性比較Table 2 Comparation of C -cleavage of six different groups

文獻[7]研究發(fā)現(xiàn)，空間位阻對斷裂反應(yīng)速率有著很大的影響。Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽兩片段相互結(jié)合時，IN的N 端剪接結(jié)構(gòu)域與IC的C 端剪接結(jié)構(gòu)域相互靠近[5，16]。為了考察空間位阻對斷裂反應(yīng)的影響，將6 種組合相互作用的結(jié)構(gòu)示意圖繪制成圖7。通過該圖我們可以發(fā)現(xiàn)：IN的N 端片段越短，參與的斷裂反應(yīng)速率越快；IC的N 端片段越短，斷裂速率越快。通過改變IN和IC的N 端插入序列的多少，可以對內(nèi)含肽斷裂反應(yīng)的速率進行調(diào)控，有望實現(xiàn)斷裂內(nèi)含肽的可控性斷裂。

2.4 Zn2+對斷裂反應(yīng)的抑制

本文中選取斷裂速度最快的組合F（N3&CG2）來研究不同濃度的Zn2+對斷裂反應(yīng)的抑制作用。當Zn2+濃度大于1 mmol/L 時，反應(yīng)體系中的目標蛋白會發(fā)生沉淀（對反應(yīng)體系中的上清部分進行取樣）。實驗結(jié)果如圖8 所示，Zn2+對斷裂反應(yīng)沒有顯著的抑制效果。與Guan 所述的0.5 mmol Zn2+對斷裂反應(yīng)有明顯的抑制效果相違背[6]。

圖7 六種組合在IN與IC結(jié)合過程中空間位阻對斷裂反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of steric hinderance on cleavage reaction during the process of INand ICrecognition

圖8 不同濃度Zn2+對組合F（N3&CG2）斷裂反應(yīng)的抑制作用Fig.8 Inhibition effects of different concentration of Zn2+on cleavage group F（N3&CG2）

Zn2+對斷裂反應(yīng)的抑制作用主要是有Zn2+結(jié)合域的存在。Ssp DnaE 斷裂內(nèi)含肽的Zn2+結(jié)合區(qū)域是由His48，Asp140，His110 以及+1Cys 組成[17]。由于斷裂內(nèi)含肽Ssp DnaE 和Npu DnaE 高度同源性，根據(jù)氨基酸序列比對，Npu DnaE 對應(yīng)的Zn2+結(jié)合位點為His48，Asp118 和+1Cys（His110 在Npu DnaE 中無對應(yīng)）。本實驗中引入的D118G 突變破壞了上述結(jié)合位點，造成Zn2+抑制效果不佳。

文獻[18]研究發(fā)現(xiàn)Mtu RecA 內(nèi)含肽中存在第二個Zn2+結(jié)合位點——Cys1 和His73。由于Npu DnaE 內(nèi)含肽與mini-Mtu RecA 內(nèi)含肽在序列和結(jié)構(gòu)上同源性很高，我們推測Npu DnaE 中的Cys1 位點可能是Zn2+結(jié)合域的關(guān)鍵氨基酸，參與Zn2+抑制。為了驗證該推論，我們將N3 片段中的首位氨基酸進行回復(fù)性突變即引入A1C 突變。突變之后的N3片段在1 mmol/L Zn2+濃度的條件下進行斷裂實驗，不同時間點進行取樣，計算斷裂率。結(jié)果表明，回復(fù)突變之后，Zn2+具有了明顯的抑制作用（圖9）。這論證了Cys1 參與Zn2+對斷裂反應(yīng)抑制作用的推斷。

圖9 N3 回復(fù)突變前后的Zn2+抑制效果比較Fig.9 Comparation of Zn2+ inhibition effects before and after A1C mutation

2.5 IN親和層析介質(zhì)對融合蛋白表達片段CG2 的純化

自制的IN親和層析介質(zhì)對CG2 蛋白純化過程圖如圖10 所示，粗蛋白樣品的上樣量為1 mL。圖中A 階段為雜蛋白清洗，B 階段為DTT 誘導(dǎo)斷裂，C段為目標蛋白洗脫。

圖10 CG2 樣品的純化過程圖Fig.10 Purification process of CG2 segment

對純化過程中各個階段取樣進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖11 所示。穿透峰中含有少量未結(jié)合的CG2 片段（圖11 第3 泳道），這可能是由于IN 層析介質(zhì)的吸附量達到了飽和。洗脫后獲得純度較高的單一的目標條帶GFP（29 kDa）。通過IamgeJ 軟件掃描SDS-PAGE 圖片上粗樣品和純化后GFP 蛋白的純度，得出目標蛋白的純化倍數(shù)為8.13 倍。利用考馬斯亮藍法測定并計算得到粗樣品中CG2 片段的含量為0.318 mg，洗脫樣品中GFP 的含量為0.173 mg，對GFP 的回收率約為54.7%。通過該方法純化得到的目的蛋白在純度和回收率上要優(yōu)于文獻[7]的方法（GFP 的純度和回收率分別為81%和43%），可能因為引入的Cys 避免了IN親和配基的脫落，間接的提高了目的蛋白的純度，此外，A1C 回復(fù)突變之后使Zn2+的抑制效果更加顯著，目標蛋白斷裂速率降低，增加了介質(zhì)的回收率。

由于IN親和層析介質(zhì)動態(tài)載量低，使得CG2片段未能完全與層析介質(zhì)結(jié)合（圖11，泳道3）。此外，在清洗雜蛋白的過程中，部分CG2 片段發(fā)生了斷裂，造成目的蛋白的損失。后續(xù)可通過優(yōu)化IN親和層析介質(zhì)的偶聯(lián)條件來增加其配基密度，提高目的蛋白的回收率。用再生緩沖液Buffer G 將結(jié)合在介質(zhì)上的IC片段（4 kDa）進行分離（如圖11 泳道6）。由圖可知，洗脫樣品中存在少量未斷裂完全的CG2 片段。同時，由于IC片段的分子量較小，洗脫后的樣品在電泳圖中的條帶不清晰。

3 結(jié)語

圖11 CG2 純化過程SDS-PAGEFig.11 SDS-PAGE results of purification process of CG2

以天然斷裂內(nèi)含肽Npu DnaE 為研究對象，利用分子生物學(xué)的方法對IN和IC結(jié)構(gòu)進行了改造，成功的構(gòu)建了3 種親和配基片段（N1、N2、N3）和兩種IC融合蛋白片段（CG1、CG2）。通過6 種不同組合的柱外斷裂實驗，可以發(fā)現(xiàn)IN和IC的N 端插入序列的多少對內(nèi)含肽斷裂活性有著重要的影響；通過不同濃度的Zn2+抑制試驗，發(fā)現(xiàn)Npu DnaE 內(nèi)含肽的第2 個Zn2+結(jié)合位點Cys1。利用在N3 片段C 末端添加的Cys 與環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)進行偶聯(lián)，成功的制備了IN親和層析介質(zhì)。以CG2 為模型蛋白，成功的對其進行了純化，獲得了高純度的目標蛋白GFP。為以Npu DnaE 斷裂內(nèi)含肽所介導(dǎo)的親和純化體系在蛋白純化領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

此外，該方法還存在一定的局限性。為了加快C端斷裂反應(yīng)的速率，向反應(yīng)體系中添加了50 mmol/L DTT，可能最終會影響含有二硫鍵的目的蛋白從而影響其功能。此外，由于IN片段中含有多余的Cys的存在，在進行共價偶聯(lián)的過程中會造成親和配基片段非定向的結(jié)合，最終影響C 端斷裂速率。