代謝工程改造大腸桿菌合成酪醇

薛宇翔，陳獻(xiàn)忠*，楊 翠，沈 微，樊 游

(1.江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

酪醇，即4-（2-羥基乙基）苯酚，作為一種重要的芳香族化合物，是天然的抗氧化劑，也是苯乙醇的衍生物[1]。酪醇天然存在于橄欖油、綠茶及酒中[2-4]，它可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害。酪醇及其衍生物具有多方面的生理學(xué)活性[5]，如抗疲勞、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗寒冷、鎮(zhèn)靜等的藥理作用[2，6]，進(jìn)而運(yùn)用在相關(guān)藥物（主要是治療心血管疾病的藥物）的研發(fā)生產(chǎn)上[7]。隨著對酪醇的生理功能的研究進(jìn)一步加深，酪醇的生產(chǎn)也受到越來越多的關(guān)注。

現(xiàn)階段，酪醇制備方法主要是天然材料提取法和化學(xué)法合成法。對于天然材料提取來說，酪醇可以從橄欖或橄欖油制備過程中產(chǎn)生的廢水中提取分離純化獲得。天然提取制備酪醇存在很多弊端，對于橄欖油提取酪醇，其回收率和純度極低，成本投入高，這些問題在工業(yè)大規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用時(shí)會帶來很大的阻力[8]。化學(xué)合成法是主要以對羥基苯乙烯、對羥基苯乙胺等為原料合成酪醇，生產(chǎn)原料價(jià)格昂貴，且在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生對環(huán)境有害物質(zhì)，這些問題制約了大規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)[9-10]。

近年來，研究者嘗試通過生物發(fā)酵法來合成酪醇，由于生物合成有能夠減少對環(huán)境的污染及方便后續(xù)酪醇的提取，同時(shí)不依賴于植物資源等優(yōu)點(diǎn)，備受關(guān)注。在自然界中，存在兩種生物合成途徑，見圖1，一種是釀酒酵母生物合成途徑：酪氨酸（TYR）經(jīng)過芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ARO8）作用脫去氨基，再經(jīng)丙酮酸脫羧酶（ARO10）的作用脫羧，最后在乙醇脫氫酶的作用下合成酪醇[11-13]；一種是酪氨酸經(jīng)酪氨酸脫羧酶（TDC）的作用生成酪胺，酪胺進(jìn)一步在酪胺氧化酶（TYO）和乙醇脫氫酶（ADH）的作用下生成酪醇[1]。研究者在釀酒酵母中過表達(dá)ARO8及ARO10 基因，以苯丙氨酸為底物，可以提高的苯乙醇合成能力，重組菌的苯乙醇的產(chǎn)量比野生型的提高了36.8%[14]。為了構(gòu)建產(chǎn)紅景天苷的大腸桿菌，研究者在大腸桿菌異源表達(dá)ARO10 和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等關(guān)鍵基因，并進(jìn)行代謝途徑改造，重組菌能夠合成紅景天苷和其前體物質(zhì)酪醇[11]。

本研究在E.coli 中異源表達(dá)ARO10 基因，并通過敲除預(yù)苯酸脫水酶編碼基因pheA 和苯乙醛脫氫酶編碼基因feaB，阻斷了苯丙氨酸途徑及4-羥基苯乙酸合成途徑，改善了酪醇的合成能力，通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高了酪醇的產(chǎn)量。在外源添加酪氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，重組菌合成酪醇的能力有所提高。

圖1 酪醇的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of tyrosol

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 菌株：大腸桿菌（Escherichia coli BL21（DE3））、E.coli JM109，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae EBY100）均為江南大學(xué)生物資源與生物能源研究中心保藏。

質(zhì)粒：pRSFDuet-1、pKD13、pKD46、pCP20 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶及蛋白分子量marker 均購自TaKaRa 生物技術(shù)公司。B 型質(zhì)粒少量快速提取試劑盒及DNA 純化與割膠回收試劑盒均購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）與異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自上海生工生物工程有限公司，酪氨酸和酪醇標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA（上海）公司，其他的分析純級試劑購自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 LB 培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉1%，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉2%，121 ℃下滅菌20 min。

M9Y 培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母粉0.025%，七水磷酸氫二鈉1.28%，磷酸二氫鉀0.3%，氯化鈉0.05%，氯化銨0.1%，115 ℃下滅菌15 min。轉(zhuǎn)接時(shí)需添加分開滅菌的硫酸鎂溶液，其最終濃度應(yīng)為5 mmol/L。

種子培養(yǎng)：劃單菌落到LB 液體培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)約12 h。用紫外分光光度儀測定種子培養(yǎng)液的OD600，轉(zhuǎn)接1 mL 種子培養(yǎng)液到50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中。

誘導(dǎo)培養(yǎng)：將培養(yǎng)基在37 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)，控制培養(yǎng)液OD600在0.6～0.8，添加一定量的IPTG，在30 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)10 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)液于4 ℃、7 000 r/min 的條件下離心3 min，并用無菌水離心洗滌，收集菌體。轉(zhuǎn)接入M9Y 培養(yǎng)基在30 ℃、200 r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

1.2.2 目的基因的克隆 本研究中所用引物見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)部合成。根據(jù)NCBI 公布的釀酒酵母（S.cerevisiae EBY100）丙酮酸脫羧酶基因ARO10（GenBank ID：851987）序列設(shè)計(jì)引物ARO10U 和ARO10D。PCR 擴(kuò)增參數(shù)：95℃變性5 min，然后94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán)后16 ℃保溫30 min，得到目的基因ARO10。

表1 基因PCR 擴(kuò)增引物列表Table 1 List of primers in this study

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將ARO10 基因PCR產(chǎn)物與pRSFDUet-1 質(zhì)粒同時(shí)用NcoI 與BamHI 雙酶切后，純化處理，用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，16℃反應(yīng)12 h，得到表達(dá)載體pRSFDUet-ARO10，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定。

1.2.4 feaB、pheA 和tyrB 基因的敲除 制備含有pKD46 的E.coli BL21（DE3）電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞[15]，將由引物YfeaBU 和YfeaBD（表1）擴(kuò)增獲得的DNA 片段（feaB 上下游同源序列、FRT 位點(diǎn)和kan基因），電轉(zhuǎn)化入含有pKD46 的E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化條件為2 mm 電轉(zhuǎn)杯、電壓2 500 V，電轉(zhuǎn)化后37 ℃下培養(yǎng)2 h，涂布于Amp 和Kan 雙抗性LB 平板上。突變盒片段進(jìn)入細(xì)胞后，在pKD46 輔助質(zhì)粒所表達(dá)的重組蛋白的幫助下，同源臂基因與大腸桿菌基因組發(fā)生同源重組，使feaB 基因區(qū)域被敲除框替換，即feaB 被kan 替換，因此，重組菌可在Kan 抗性平板上生長。平板培養(yǎng)12 h 后挑取單菌落，用鑒定性引物NfeaBU 和NfeaBD（表1）PCR 擴(kuò)增，通過確定敲除框上下游是否正確交換來鑒定的敲除。之后將pCP20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）ΔfeaB：：kan 菌株中，42 ℃培養(yǎng)12 h，取菌液稀釋，涂布于LB 固體平板。pCP20 質(zhì)粒含編碼FLP 重組酶的基因，可介導(dǎo)2 個(gè)FRT 位點(diǎn)間的切除，從而消除kan 基因。pCP20 為溫敏型質(zhì)粒，培養(yǎng)溫度高于37℃時(shí)會自動(dòng)丟失，因此挑取單菌落分別點(diǎn)到Kan 抗性LB 平板和LB 平板上培養(yǎng)12 h，挑取在LB 固體培養(yǎng)基平板上生長而Kan 抗性平板上不生長的菌落，即為E.coli BL21（DE3）ΔfeaB。

制備含有pKD46 的E.coli BL21（DE3）ΔfeaB的感受態(tài)細(xì)胞，將由引物YpheAU 和YpheAD（表1）擴(kuò)增獲得的DNA 片段（含pheA 上下游同源序列、FRT 位點(diǎn)和kan 基因），利用同上的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)入含有pKD46 的E.coli BL21（DE3）ΔfeaB 的感受態(tài)細(xì)胞。利用同上的方法，最終得到了E.coli BL21（DE3）ΔfeaBΔpheA。

制備含有pKD46 的E.coli BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞，將引物YtyrBU 和YtyrBD（表1）擴(kuò)增獲得DNA 片段（含tyrB 上下游同源序列、FRT 位點(diǎn)和kan 基因），利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)入含有pKD46 的E.coli BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)標(biāo)記基因彈出后，最終獲得E.coli BL21（DE3）ΔtyrB。

1.2.5 酪醇和酪氨酸的高效液相測定 使用高效液相色譜（HPLC）。色譜條件如下：HPLC 色譜柱為COSMOSIL-5C18-MS-Ⅱ（3.0 ID×150 mm）[16]。流動(dòng)相A 為0.1%三氟乙酸，流動(dòng)相B 為純甲醇，柱溫為30 ℃，紫外檢測器，流速設(shè)置為0.4 mL/min。流動(dòng)相需用0.22 μm 孔徑的水系膜進(jìn)行真空抽濾，使用前超聲10 min 除去氣泡。

樣品處理：取發(fā)酵液100 mL，12 000 r/min 離心5 min 收集上清，經(jīng)0.22 μm 孔徑濾膜過濾后加入HPLC 樣品瓶對發(fā)酵液中的酪醇和酪氨酸含量進(jìn)行檢測[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酪醇的重組大腸桿菌構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以釀酒酵母（S.cerevisiae EBY100）染色體DNA為模版，PCR擴(kuò)增得到ARO10 基因片段，目的基因經(jīng)NcoI 與BamHI 酶切純化后插入到表達(dá)載體pRSFDUet-1 的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，獲得重組表達(dá)載體pRSFDUet-ARO10，酶切驗(yàn)證（如圖2 所示），ARO10 片段大小為1 908 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，證明表達(dá)載體pRSFDUet-ARO10構(gòu)建成功。

圖2 酶切產(chǎn)物電泳檢測圖Fig.2 Enzyme-digested product of the recombinant plasmid pRSFDUet-ARO10

2.1.2 重組菌發(fā)酵生產(chǎn)酪醇 將pRSFDUet-1 質(zhì)粒和重組表達(dá)載體pRSFDUet-ARO10 分別導(dǎo)入E.coli BL21（DE3）中，獲得重組菌BE0 和重組菌BE1，兩株重組菌發(fā)酵培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，重組菌BE0 發(fā)酵液中未檢測到酪醇，可見大腸桿菌本體內(nèi)不能合成酪醇。重組菌株BE1的酪醇產(chǎn)量達(dá)到0.35 mmol/L，可知通過丙酮酸脫羧酶編碼基因ARO10 異源表達(dá)，可以建立E.coli 合成酪醇的途徑。另一方面，雖然重組質(zhì)粒進(jìn)行游離表達(dá)，而且?guī)в蠺7 的強(qiáng)啟動(dòng)子，但是酪醇的產(chǎn)量還是較低的，這說明重組E.coli 從葡萄糖到酪醇的合成途徑較長，而且芳香族氨基酸合成途徑中存在的反饋調(diào)節(jié)，也可能阻礙酪醇的合成。

圖3 外源添加酪氨酸對重組菌BE1 酪醇合成的影響及重組菌BE0 發(fā)酵生產(chǎn)酪醇過程Fig.3 Effect of supplementing tryrosine on the tryrosol production for the recombinant strain BE1 and the course of producing tyrosol by the recombint strain BE0

2.2 外源添加酪氨酸對重組菌BE1 酪醇合成的影響

由圖1 代謝途徑可知，酪氨酸和酪醇合成過程中需要利用相同的前體—4-羥基苯丙酮酸（4HPP）。因此，推測胞內(nèi)的酪氨酸濃度可能會影響酪醇的合成。通過添加不同濃度（0、1.0、2.0 mmol/L）的酪氨酸考察了重組菌BE1 對酪醇的產(chǎn)量的影響。發(fā)酵結(jié)果及酪醇產(chǎn)量提高率如圖3 和表2 所示。

表2 添加不同濃度酪氨酸時(shí)重組菌BE1 合成酪醇的產(chǎn)量Table 2 Tyrosol production of different concentration tyrosine sumplemented in M9Y for BE1

從圖3 中可以得出，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的酪氨酸，酪醇的產(chǎn)量都有了較大的提高。發(fā)酵液中未檢測到酪氨酸，說明發(fā)酵液中幾乎沒有酪氨酸殘留。從代謝途徑上可以推測重組菌BE1 中大腸桿菌本體內(nèi)基因tyrB 可能導(dǎo)致酪氨酸生成4-羥基苯丙酮酸，進(jìn)而產(chǎn)生了酪醇。根據(jù)以上結(jié)果，決定保留該菌株的酪氨酸合成途徑。

2.3 改造旁路代謝途徑并提高酪醇產(chǎn)量

2.3.1 敲除基因feaB 和pheA 由代謝途徑（圖1）分析可知，敲除feaB 和pheA 基因，可以阻斷4-羥基苯乙酸的合成途徑和苯丙氨酸代謝途徑，推測可能提高酪醇產(chǎn)量。因此，進(jìn)一步構(gòu)建含有feaB 基因同源臂和kan 抗性基因的刪除盒并轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）菌株，篩選轉(zhuǎn)化子并經(jīng)誘導(dǎo)彈出kan 抗性基因。突變株的PCR 鑒定結(jié)果如圖4（a）所示，原始菌株P(guān)CR 產(chǎn)物大小為1 780 bp，抗性基因彈出后的突變株P(guān)CR 產(chǎn)物大小為398 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，證明成功敲除了feaB 基因。在敲除feaB 基因的基礎(chǔ)上，敲除pheA 基因，阻斷苯丙氨酸代謝途徑。將kan 抗性基因整合E.coli BL21（DE3）ΔfeaB 菌株的pheA 基因位點(diǎn)，轉(zhuǎn)入pCP20 質(zhì)粒消除Kan 抗性后轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證，結(jié)果如圖4（b）所示，原始序列為1 658 bp，突變株499 bp。與預(yù)期結(jié)果一致，證明成功敲除了pheA 基因。

圖4 PCR 驗(yàn)證Fig.4 PCR identification

2.3.2 基因敲除后對酪醇產(chǎn)量的影響 將構(gòu)建好的表達(dá)載體pRSFDUet-ARO10 導(dǎo)入E.coli BL21（DE3）ΔfeaB 和E.coli BL21（DE3）ΔfeaBΔpheA，獲得重組突變菌株BE3 和BE4。將重組菌BE1、BE3和BE4 發(fā)酵48 h，收集發(fā)酵液處理后檢測酪醇，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 基因敲除對酪醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of gene deletion on tryrosol production

從圖5 中可以看出，對于菌株BE3 來說，酪醇產(chǎn)量達(dá)到0.41 mmol/L，可知，敲除feaB 基因，較BE1 提高了17.1%，說明敲除feaB 基因，有助于提高酪醇的合成能力；對于菌株BE4 來說，可產(chǎn)酪醇0.91 mmol/L，較BE1 提高了160%，說明在敲除feaB基因基礎(chǔ)上，敲除pheA 基因，可顯著提高酪醇的合成能力。進(jìn)而說明敲除feaB 和pheA 基因，阻斷了4-羥基苯乙酸與苯丙氨酸生成途徑，使葡萄糖更多地流向酪醇成途徑，從而提高了酪醇的合成能力。

2.4 重組突變菌株BE4 產(chǎn)酪醇條件的優(yōu)化

2.4.1 重組蛋白誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的優(yōu)化 溫度對酶的活性及其表達(dá)有著極大的影響[18]，考察了不同誘導(dǎo)溫度（20、25、27、30 ℃對酪醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6（a）所示。從圖中6（a）可以看出誘導(dǎo)溫度在25 ℃時(shí)，酪醇的產(chǎn)量最高，產(chǎn)量可達(dá)3.61 mmol/L。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對重組蛋白表達(dá)有重要影響?？疾炝嗽诓煌琌D 值（0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1）時(shí)誘導(dǎo)劑IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)對酪醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6（b）所示。圖6（b）表明OD 值高于0.6 時(shí)并不利于酪醇的產(chǎn)生，當(dāng)OD 值在0.6～0.8，大腸桿菌處于對數(shù)生長期，生理狀態(tài)良好，更利于最終酪醇的產(chǎn)生。最終酪醇產(chǎn)量可達(dá)3.48 mmol/L。

2.4.2 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 誘導(dǎo)劑濃度的大小可以起到促進(jìn)或抑制的作用，所以適當(dāng)濃度的誘導(dǎo)劑是十分關(guān)鍵的?？疾炝瞬煌琁PTG 濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）對酪醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6（c）所示。由圖中6（c）可以看出當(dāng)IPTG 濃度在0.8 mmol/L時(shí)，酪醇產(chǎn)量最低，當(dāng)IPTG 濃度在0.2 mmol/L 時(shí)，酪醇產(chǎn)量最高，產(chǎn)量可以達(dá)到4.15 mmol/L。

圖6 重組菌誘導(dǎo)條件對酪醇合成的影響Fig.6 Optimization of induction conditions for tyrosol produciton

2.5 基因tyrB 對酪醇合成的影響

2.5.1 基因tyrB 的刪除 為刪除E.coli BL21（DE3）菌株的tyrB 基因，構(gòu)建含有同源臂和Kan 抗性基因的刪除盒，將其轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）并整合到基因組上，篩選轉(zhuǎn)化子并經(jīng)誘導(dǎo)彈出Kan 抗性基因。野生型與突變型轉(zhuǎn)化子菌落PCR 驗(yàn)證，原始菌株P(guān)CR 產(chǎn)物大小為1 059 bp，抗性基因彈出后的突變株P(guān)CR 產(chǎn)物大小為254 bp。結(jié)果如圖7 所示，與預(yù)期的大小一致，證明基因tyrB 已成功敲除。

圖7 大腸桿菌tyrB 基因敲除的PCR 驗(yàn)證Fig.7 PCR identification of the gene tyrB deletion in E.coli strain

2.5.2 刪除基因tyrB 對重組菌合成酪醇的影響將構(gòu)建好的表達(dá)載體pRSFDUet-ARO10 導(dǎo)入E.coli BL21（DE3）ΔtyrB 中，獲得重組大腸桿菌BE2。將兩株重組菌BE1 和BE2 經(jīng)種子液培養(yǎng)、LB 液體培養(yǎng)、IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，分別轉(zhuǎn)接外源添加不同濃度（0、1、2.8 mmol/L）酪氨酸的M9Y 培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)果如圖8 所示。

圖8 外源添加酪氨酸對重組菌BE1 和重組菌BE2 酪醇合成的影響Fig.8 Effect of supplementing tryrosine on the tryrosol production for the recombinant strain BE2 and BE1

從圖8 可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基不添加酪氨酸時(shí)，BE1 可產(chǎn)酪醇0.86 mmol/L，BE2 可產(chǎn)酪醇2.18 mmol/L，BE2 的合成能力高于BE1，可知，刪除基因tyrB 可以提高重組菌酪醇的合成能力。從圖6 可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基外源添加2.8 mmol/L 的酪氨酸與1 mmol/L 酪氨酸相比，重組菌BE1 和BE2 的合成能力均有提高。發(fā)酵液中未檢測到酪氨酸，說明發(fā)酵液中幾乎沒有酪氨酸殘留?？芍?，大腸桿菌胞內(nèi)存在多條催化酪氨酸合成4-羥基苯丙酮酸的途徑。

3 討論

本研究通過在E.coli BL21（DE3）中異源表達(dá)ARO10 基因，獲得了可以合成酪醇的重組大腸桿菌。通過刪除旁路代謝途徑及對培養(yǎng)條件優(yōu)化，利用10 g/L 葡萄糖作為碳源，發(fā)酵48 h 酪醇產(chǎn)量可達(dá)4.15 mmol/L。Yasuharu Satoh 通 過 在E.coli MG1655 中異源表達(dá)TYO 及TDC 基因，重組菌利用10 g/L 葡萄糖作為碳源，搖瓶發(fā)酵48 h，酪醇產(chǎn)量可達(dá)0.5 mmol/L[1]。文獻(xiàn)[11]通過在E.coli MG1655中異源表達(dá)ARO10 基因，并對代謝途徑進(jìn)行了改造，利用20 g/L 葡萄糖作為碳源，酪醇產(chǎn)量可達(dá)5.4 mmol/L。與之相比，本研究僅對酪氨酸合成途徑上的個(gè)別基因進(jìn)行改造，重組菌合成酪醇的能力還有進(jìn)一步的提升空間。本研究中ARO10 基因來源于釀酒酵母，在大腸桿菌的表達(dá)效率相對較低。下一步將對ARO10 基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，進(jìn)一步改善酪醇的合成能力。

由于大腸桿菌體內(nèi)酪醇的前體物質(zhì)4-羥基苯丙酮酸合成途徑較長[15]，對于增強(qiáng)酪醇的合成能力，在未來還有很多研究要做。由酪醇的代謝途徑可知（圖1），4-羥基苯丙酮酸也是合成酪氨酸的前體物質(zhì)，下一步將采用過量合成酪氨酸的菌株合成酪醇。過去幾十年里，有關(guān)于過量合成酪氨酸的菌株的研究成一直是研究熱點(diǎn)[19-21]。理論推測，利用產(chǎn)10 g/L 酪氨酸的工程化的大腸桿菌可以產(chǎn)酪醇7.6 g/L。這個(gè)產(chǎn)量比從橄欖油中提取得到的酪醇產(chǎn)量高3 倍。因此，利用合成酪氨酸能力強(qiáng)的宿主菌以葡萄糖為底物來提高重組菌酪醇的合成能力，將成為下一步的研究重點(diǎn)。

4 結(jié)語

在外源添加酪氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)合成酪醇，可以改善酪醇的合成能力，推測大腸桿菌體內(nèi)存在催化酪氨酸合成4-羥基苯丙酮酸的酶。下一步，將進(jìn)一步探索以酪氨酸為底物的全細(xì)胞催化合成酪醇的條件。