高抑菌活性物質產生菌的選育、優(yōu)化及其特性表征

李 勛，周楠迪，田亞平

（江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

抗生素是全球最廣泛使用的抗菌藥物，但其在醫(yī)藥與畜牧方面的過度使用造成嚴重后果，耐抗生素細菌的出現(xiàn)，使得抗生素的使用面臨嚴重挑戰(zhàn)[1-2]，因此，尋找可代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素藥物且對人體與環(huán)境無毒害、無殘留的天然抑菌物質成為研究熱點，細菌素獨特的優(yōu)點，使其成為抗生素類藥物替代品的首要選擇，在生物飼料添加劑、微生態(tài)制劑[3]、生物藥品等領域具有較好的應用前景[4]。細菌素是由某些細菌代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白復合物[5]。芽孢桿菌（Bacillus）在自然界中分布廣泛，生理特性豐富，能夠產生酶類、胞外桿菌肽、大環(huán)內酯、類噬菌體顆粒等多種拮抗物質[5-6]。

地衣芽孢桿菌能夠代謝產生多種物質，在工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中應用較多，是一種具有極高應用價值的微生物[7]。地衣芽孢桿菌產抑菌活性物質種類較多，其中，抗菌肽因其可作為抗生素的替代品，受到重視。Mendo 等[8]報道地衣芽孢桿菌189 可產生抑菌多肽，可以抑制革蘭氏陽性菌株的生長。樊陳[1]等從地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中分離出一種具有廣譜抑菌效果的抗菌肽，該抑菌肽對革蘭氏陽性菌株抑制效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌株。紀兆林等[9]對地衣芽孢桿菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，抑菌率提升了34.6%，并從發(fā)酵液中分離出一種穩(wěn)定性高的抑菌肽。

本研究從實驗室保藏菌株中篩選出一株高抑菌活性物質產生菌，對其菌落形態(tài)、生理生化特征與16S rRNA 基因水平鑒定。通過單因素試驗與正交試驗，確定其最適發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。使用硫酸銨分級鹽析與離子交換層析對發(fā)酵液中抑菌物質進行分離，并對分離純化所得抑菌物質的特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 實驗室保藏菌株JN-814B、JN-814C、JN-814D、JN-814E、JN-814、JN-814G、JN-814LX、凝結芽孢桿菌ACCC10229、凝結芽孢桿菌CICC21736、凝結芽孢桿菌0076（T）。

1.1.2 指示菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginose）、大腸桿菌（E.coli）、酵母菌（Yeast）、黑曲霉（Aspergillus niger）。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基；YPD 培養(yǎng)基；PDA 培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基向其中添加1.5%～2%瓊脂粉。

初始培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物質的檢測 采用管碟法[10]檢測抑菌活性物質。

1.2.2 目的菌株的選育 將實驗室保藏菌株分別活化后，接種入LB 培養(yǎng)基，適宜條件下培養(yǎng)12 h，發(fā)酵液10 000 r/min，4 ℃離心20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，以管碟法測定上清液對其的抑制作用，選擇抑菌效果最佳的菌株作為目標菌株。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用單因素實驗，將初始培養(yǎng)基中碳源葡萄糖分別替換為蔗糖、乳糖、麥芽糖、環(huán)糊精、玉米淀粉，將其中氮源物質胰蛋白胨替換為魚粉蛋白胨，豆餅、豆粕、硫酸銨、尿素，將其中無機鹽分別替換為氯化鉀，磷酸氫二鉀，磷酸氫二鈉，硫酸鎂。分別對單因素優(yōu)化出的3 個營養(yǎng)元素與酵母粉進行添加量優(yōu)化。根據優(yōu)化結果，設置3個水平對其進行L9（34）正交試驗。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，在其他條件不變的情況下，分別對發(fā)酵初始pH，裝液量，發(fā)酵溫度，接種量，發(fā)酵時間進行優(yōu)化。

1.2.5 優(yōu)化結果的驗證 為驗證培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件優(yōu)化結果的可靠性，對優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件進行驗證，分別以優(yōu)化前與優(yōu)化后進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液上清液的抑菌效果。

1.2.6 抑菌效價的計算 抑菌效價計算采用管碟法：二劑量法[11]。

1.3 抑菌活性物質的分離純化

1.3.1 硫酸銨分級鹽析[12]將發(fā)酵液離心，取上清液，分別向其中添加硫酸銨至飽和度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，離心，取沉淀，將沉淀溶于50 mmol/L，pH 6.8 的Tris-HCl 緩沖液中，將溶解液置于緩沖液中透析除鹽[13]，檢測透析液的抑菌活性[14]。

1.3.2 DEAE-Sephrose-FF 陰離子交換層析 硫酸銨沉淀后的溶解液，DEAE-Sephrose-FF 陰離子交換層析柱經0.05 mmol/L，pH 6.8 的Tris-HCl 緩沖液平衡后，上樣量1 mL，使用0%、27%、46%、100%1 mol/L NaCl Tris-HCl 緩沖液進行梯度洗脫，檢測波長280 nm，收集各峰組分并濃縮，檢測其抑菌活性[15]。

1.4 抑菌肽的特性研究

1.4.1 抑菌肽蛋白酶敏感性 取陰離子交換分離后的抑菌活性物質樣品，分別置于6 支試管中，調節(jié)pH 至所用蛋白酶最適pH，分別加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、亮氨酸氨肽酶，脯氨酸氨肽酶，使酶的最終濃度為10 mg/mL，對照組添加無菌水，在各酶最適溫度水浴30 min 后調pH 至中性。檢測各組樣品抑菌活性。

1.4.2 抑菌肽氨基酸組成分析 對離子交換后所得抑菌肽進行濃鹽酸水解，高效液相色譜檢測水解后樣品中的氨基酸組成，與未經水解的樣品進行對比，獲得目標抑菌肽的氨基酸組成。

1.4.3 抑菌肽溫度穩(wěn)定性 取陰離子交換分離后的抑菌活性肽樣品，配置成0.02 g/mL 溶液，放入離心管中，分別置于50，60，70，80，90，100 ℃條件下水浴20 min，冷卻至室溫后測定抑菌活性。

1.4.4 抑菌肽pH 穩(wěn)定性 取7 管陰離子交換分離后的抑菌活性肽樣品，使用0.05 mol/L 的NaOH 溶液與0.05 mol/L HCl 分別調整pH 4～10，37 ℃處理12 h，調整pH 至7.0 后測定其抑菌活性

1.4.5 抑菌肽抑菌譜 將硫酸銨初步分離得到的抑菌肽分別對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、酵母等菌株做抑菌活性檢測。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性物質產生菌的選育

2.1.1 目的菌株的選擇 將實驗室保藏的10 株菌發(fā)酵液上清液抑菌效果如圖1 所示。其中，菌株JN-814C 抑菌圈直徑最大，對金黃色葡萄球菌抑制效果最明顯，故選擇菌株JN-814C 為抑菌活性物質產生菌進行研究。

2.1.2 菌株JN-814C 的鑒定 菌株JN-814C 在LB培養(yǎng)基上生長良好，菌落為淺黃色圓形菌落，不透明，表面光滑，菌落邊緣呈不規(guī)則狀。其生理生化特征見表1。

對菌株JN-814C 進行16S rRNA 測序，將所測得的序列與Genbank 中的16S rRNA 相似性進行比較。菌株JN-814C 與Bacillus chenifoormis 的16S rRNA 序列同源性達到99%以上。

綜合生理生化鑒定和16S rRNA 測序結果，可以認為菌株JN-814C 為地衣芽孢桿菌（Bacillus cheniformis）的一個亞種。

圖1 實驗室保藏菌株發(fā)酵液上清液抑菌效果Fig.1 Antibacterial results of differernt bacterial strains preserved in the laboratory

2.2 菌株JN-814C 產抑菌活性物質的優(yōu)化

2.2.1 菌株JN-814C 細胞生長與發(fā)酵曲線 由圖2 可知，菌株JN-814C 接種入發(fā)酵培養(yǎng)基后即開始產生抑菌活性物質，在22 h 時分泌產物抑菌圈直徑達到最大值，抑菌凈直徑約為23 mm，發(fā)酵30 h 以后，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質被消耗，不利于代謝產物積累，發(fā)酵液中活菌數量也逐漸減少，同時，產物抑菌圈直徑開始逐漸下降，發(fā)酵液中抑菌活性物質的量開始減少。因此推斷抑菌活性物質主要產生于菌體生長的對數期，在發(fā)酵后期抑菌活性物質的減少可能與菌體分泌蛋白酶有關。故選擇22 h 作為發(fā)酵培養(yǎng)周期。

圖2 菌株JN-814C 產抗菌物質的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of strain JN-814C for an antibacterial substance productionan antibacterial substance production

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定 由圖3 可知，培養(yǎng)基最佳碳源、氮源、無機鹽分別為糊精、胰蛋白胨、硫酸鎂。其最適添加量分別為糊精0.5%，胰蛋白胨0.5%，硫酸鎂0.1%。培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化結果見表2。

經單因素試驗與正交試驗，確定培養(yǎng)基中各因素影響大小依次為A＞C＞B＞D，最優(yōu)培養(yǎng)及配方為糊精5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L，硫酸鎂3 g/L。

2.2.3 培養(yǎng)條件的確定 培養(yǎng)條件產抑菌物質的抑菌活性的影響見圖4。

1）種子培養(yǎng)時間的確定。由圖4（a）可以看出，種子培養(yǎng)時間最佳為22 h，此時菌體生長處于對數末期，菌體生長速率與菌體數量均處在較高水平，故選擇種齡為22 h。

2）培養(yǎng)溫度對抑菌效果的影響。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別在25、28、31、34、37、40、43 ℃溫度條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液上清液抑菌效果。由圖4（b）可知，溫度對發(fā)酵上清液抑菌效果影響較大，低溫和高溫都不利于抑菌活性物質的產生，在37 ℃時，分泌產物抑菌圈直徑大到最大，所以選擇37 ℃作為發(fā)酵的培養(yǎng)溫度。

3）初始pH 對抑菌效果的影響。將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培養(yǎng)22 h 后檢測發(fā)酵上清液的抑菌效果。由圖4（c）可知，在pH 范圍為6.0～9.0 內，培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵液抑菌效果基本無影響。

4）裝液量對抑菌效果的影響。分別向250 mL錐形瓶中添加20、30、40、50、60、70、80 mL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)后測定發(fā)酵上清液的抑菌效果。由圖4（d）可知，裝液量在50 mL 以內時，隨著裝液量增加，上清液抑菌圈直徑逐漸增大，裝液量超過50 mL 以后，上清液抑菌圈直徑迅速下降，在裝液量50 mL 時分泌產物抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇50 mL 作為發(fā)酵過程裝液體積。

圖3 培養(yǎng)基成分對產抑菌物質的抑菌活性的影響Fig.3 Effects of carbon source on antibacterial activity

表2 培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化結果Table 2 Orthogonal test results of medium composition

圖4 培養(yǎng)條件產抑菌物質的抑菌活性的影響Fig.4 Effects of fermentation conditions on antibacterial activity

5）接種量對抑菌效果的影響。由圖4（e）可以看出，接種量在1%～10%范圍內時，接種量大小對發(fā)酵液抑菌效果影響較大，接種量在2%時，抑菌圈最大，發(fā)酵液的抑菌效果最佳，隨著接種量增大，上清液抑菌圈直徑呈減小趨勢。

6）優(yōu)化結果的驗證。為驗證培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件優(yōu)化結果的可靠性，對優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件進行驗證，分別對優(yōu)化前與優(yōu)化后進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液上清液的抑菌效果。結果如圖5 所示。

優(yōu)化后發(fā)酵液上清液抑菌效果得到提高，通過計算，優(yōu)化后發(fā)酵液抑菌效果較未優(yōu)化的發(fā)酵液抑菌效果提高41.4%。

圖5 不同發(fā)酵條件下的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effects of different fermentation conditions

2.3 抑菌活性物質的分離純化

2.3.1 硫酸銨沉淀粗提取 硫酸銨鹽析如圖6 所示。由圖6 可知，菌株JN-814C 的發(fā)酵上清液經硫酸銨分級鹽析濃縮后，抑菌活性物質主要集中在硫酸銨飽和度為40%～70%的范圍之內，在70%～80%范圍內抑菌活性物質的量減少，說明該菌株所產抑菌性物質可被硫酸銨沉淀，具有蛋白性質，為保證抑菌活性物質的收率，選擇硫酸銨飽和度40%～80%作為上清液處理濃度。

圖6 硫酸銨鹽析Fig.6 Ammonium sulfate salting-out

2.3.2 DEAE-Sepharose-FF 陰離子交換層析分離選用DEAE-Sepharose-FF 對硫酸銨粗提液進行分離，收集陰離子交換層析洗脫的個各峰組分，富集濃縮后測定其抑菌能力，結果抑菌性物質分布于峰a 與峰b，其中，a 峰為穿透峰，峰b 為27%NaCl 洗脫峰，分別收集峰a 與峰b，冷凍干燥得到純化的抑菌肽。

圖7 DEAE-Sepharose-FF 離子交換圖譜Fig.7 DEAE-Sepharose-FF anion exchange chromatogram

圖8 層析出峰的各峰抑菌效果Fig.8 Bacteriostatic spectrum of the three fractions

2.4 抑菌物質的特性研究

發(fā)酵液中抑菌活性物質經硫酸銨沉淀與DEAE陰離子交換層析后得到分離，表現(xiàn)出一定的蛋白性，對其進行蛋白酶處理。

2.4.1 蛋白酶敏感性 蛋白酶對抑菌活性的影響如圖9 所示。由圖9 可知，純化后的抑菌活性物質經7 種蛋白酶處理后，堿性蛋白酶對其抑菌活性影響較大，其次為亮氨酸氨肽酶，結果表明該抑菌物質是多肽類物質，其肽鏈N 端存在亮氨酸殘基。

圖9 蛋白酶對抑菌活性的影響Fig.9 Effects of proteases on antimicrobial activity

表3 抑菌肽的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of antimicrobial peptide

2.4.2 抑菌肽氨基酸組成 抑菌肽氨基酸的組成如表4 所示。氨基酸分析表明，分離出的抑菌肽主要含有9 種氨基酸，其中谷氨酸的含量處于較高水平。

表4 抑菌肽氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of antimicrobial peptide

2.4.3 熱穩(wěn)定性 溫度對抑菌活性的影響如圖10所示。由圖10 可知，純化后的抑菌肽經不同溫度處理，在80 ℃以內時，抑菌效果保持在較高水平，且相對穩(wěn)定，超過80 ℃以后，抑菌效果明顯下降，說明該菌株所產抑菌肽具有一定的溫度耐受性，但對80 ℃以上高溫耐受性較差。

圖10 溫度對抑菌活性的影響Fig.10 Effects of temperature on antimicrobial activity

2.4.4 pH 穩(wěn)定性 將純化后抑菌肽樣品在不同pH條件下處理后，抑菌性實驗結果如圖11 所示，從圖11 可以看出抑菌圈直徑變化較小，說明在pH 4～10范圍內，該細菌素活性較為穩(wěn)定。

圖11 p H 對抑菌活性的影響Fig.11 Effects of pH on antimicrobial activity

2.4.5 抑菌肽抑菌譜的測定 抑菌肽的抑菌譜如表3 所示。結果表明，分離所得抑菌肽對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出很好的拮抗性，對革蘭氏陰性菌及真菌無抑制作用。

3 結語

本研究篩選出一株產抑菌活性物質較高的菌株，地衣芽孢桿菌JN-814C，通過發(fā)酵優(yōu)化，將其抑菌效價提高41.4%，對發(fā)酵液中抑菌活性物質進行分離純化后，通過蛋白酶處理與氨基酸分析確定其為一種抑菌肽，研究表明，該抑菌肽穩(wěn)定性較好，其對革蘭氏陽性菌有較好的抑制作用，與文獻報道一致。