關(guān)于氨基酸分離的創(chuàng)新層析實(shí)驗(yàn)的探究

朱彩瑜 趙雨彤 劉先俊 朱勇 汪長(zhǎng)東

摘要：通過(guò)對(duì)創(chuàng)新層析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象的討論，給出了對(duì)該創(chuàng)新層析實(shí)驗(yàn)合理性的評(píng)價(jià)以及提高實(shí)驗(yàn)可行性的相關(guān)建議，可為其他物質(zhì)的分離提供參考。

關(guān)鍵詞：氨基酸；層析；異?，F(xiàn)象

中圖分類號(hào)：Q52 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2019）01-0274-05

一、引言

物質(zhì)的分離常用到色譜分析的方法，而以往色譜分析的固定相往往是固定不動(dòng)的，只有流動(dòng)相才會(huì)運(yùn)動(dòng)，如薄層色譜以硅膠、氧化鋁等為固定相，離子交換色譜以離子交換填料為固定相[1-4]。本實(shí)驗(yàn)利用水相與流動(dòng)相流動(dòng)速度的差異作為結(jié)果判斷依據(jù)，采取以流動(dòng)物質(zhì)水為固定相的紙層析法來(lái)分離氨基酸。由于濾紙中纖維素分子含大量羥基，因而纖維素也具有硅膠的部分性質(zhì)，其親水性強(qiáng)，能吸收約22%的水分[5]形成流動(dòng)固定相。

運(yùn)用紙層析法分離物質(zhì)，試樣無(wú)需經(jīng)過(guò)預(yù)處理，方法簡(jiǎn)便，儀器廉價(jià)，可用于染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、中草藥等的有效成分的分離分析[5，6]，對(duì)日常生產(chǎn)生活具有深刻的意義。

二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（一）實(shí)驗(yàn)原理

轉(zhuǎn)氨基是氨基酸代謝過(guò)程中的一個(gè)重要反應(yīng)。每種轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，轉(zhuǎn)氨酶廣泛分布于機(jī)體各組織、器官。在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的α氨基與α酮酸的α酮基的互換反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用。

本實(shí)驗(yàn)用紙層析法觀察-酮戊二酸與丙氨酸在肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）催化下的轉(zhuǎn)氨基作用。

實(shí)驗(yàn)分為測(cè)定組與對(duì)照組。測(cè)定組發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，在最后的體系中存在有兩種氨基酸；而對(duì)照組不發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，最后體系中只有反應(yīng)物中一種氨基酸。用煮沸方法使得谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）失活而終止反應(yīng)，然后用紙層析法對(duì)兩種氨基酸進(jìn)行分離鑒定。

紙層析法按操作方法分成兩類即垂直型和水平型。垂直型是將濾紙條懸掛，使流動(dòng)相向上或向下擴(kuò)散。水平型是將圓形濾紙置于水平位，溶劑由中心向四周擴(kuò)散。紙層析法的分離原理是分配層析，分配層析是利用混合物在兩種或兩種以上的不同溶劑中分配系數(shù)的不同而使物質(zhì)分離的方法，相當(dāng)于一種連續(xù)的萃取過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采取水平型紙層析法，以濾紙為支撐介質(zhì)，水被吸附在濾紙的纖維之間形成固定相。某些與水不相溶的有機(jī)溶劑如醇、酚等為常用的流動(dòng)相。把預(yù)分離的物質(zhì)加在紙的一端，使流動(dòng)溶劑經(jīng)此向另一端移動(dòng)，這樣物質(zhì)隨著流動(dòng)相的移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)、動(dòng)態(tài)的不斷分配。由于物質(zhì)分配系數(shù)的差異[7]，移動(dòng)速度就不一樣，在固定相中分配趨勢(shì)較大的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就慢；反之，在流動(dòng)相分配趨勢(shì)較大的成分，移動(dòng)速度就快，而水項(xiàng)流動(dòng)速度最慢，最終不同的組分彼此分離，水相與流動(dòng)相流動(dòng)速度的差異可作為結(jié)果判斷依據(jù)。物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速率可以用比移值（Rf）表示[8，9]：物質(zhì)在一定的溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故比移值（Rf）也相對(duì)恒定，因此在同一層析體系中可用Rf值來(lái)鑒別被分離的物質(zhì)[10]。用紙層析法分離氨基酸混合物時(shí)，影響Rf值的主要因素是側(cè)鏈基團(tuán)的極性。例如丙氨酸側(cè)鏈極性要小于谷氨酸側(cè)鏈的極性，所以混合物中丙氨酸在濾紙上運(yùn)動(dòng)要快，Rf值大；反之谷氨酸在濾紙上運(yùn)動(dòng)慢，Rf值小。

（二）實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.儀器：剪刀；鑷子；托盤；培養(yǎng)皿；表面皿；毛細(xì)管；吹風(fēng)機(jī)；水浴箱；烘箱。

2.試劑：（1）pH7.4 0.01mol/L磷酸緩沖液；

（2）0.2mol/L丙氨酸溶液；（3）0.1mol/L α-酮戊二酸溶液；（4）0.1mol/L谷氨酸溶液；（5）0.5%茚三酮溶液；

（6）層析溶液：乙醇和蒸餾水的混合液（（體積比）乙醇：蒸餾水=3∶1）。

（三）實(shí)驗(yàn)步驟

1.肝勻漿制備：取新鮮的動(dòng)物肝臟0.5g，在研缽中剪碎，研成勻漿，加入9倍體積（4.5ml）pH7.4 0.01mol/L磷酸緩沖液。

2.轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)：取干燥小試管（或離心管）二支，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，各加入肝勻漿10滴，測(cè)定管加入37℃水浴保溫10min，對(duì)照管放入沸水浴中煮10min，待對(duì)照管冷卻后，于兩試管中分別加入0.1mol/L丙氨酸10滴，0.1mol/L α-酮戊二酸10滴，pH7.4 0.01mol/L磷酸緩沖液1.5ml，搖勻，放進(jìn)37℃水浴保溫30min，保溫完畢，立即將測(cè)定管放入沸水浴中煮沸10min以終止反應(yīng)，取出冷卻后，過(guò)濾。取濾液備用。

3.層析：取直徑9cm圓形濾紙一張，用圓規(guī)作半徑1cm同心圓，通過(guò)圓心作兩條相互垂直的線，在1、3兩處分別點(diǎn)測(cè)定管和對(duì)照管上清液1—2滴。方法是用毛細(xì)管在紙上點(diǎn)樣，注意斑點(diǎn)不可太大（一般為直徑0.5cm）而且每點(diǎn)一滴需干燥后方可再點(diǎn)第二滴，在2、4兩處則各加0.1mol/L丙氨酸和0.1mol/L谷氨酸1—2滴。

在濾紙圓心處打一小孔（如鉛筆芯大?。┝砣⊥愋蜑V紙約1cm2，下半剪成須狀，卷成圓筒，如燈芯，插入小孔（勿使突出濾紙面）。

將層析溶劑放入直徑3—5cm的表面皿正中，（表面皿放入直徑9cm的培養(yǎng)皿正中）將濾紙平放在培養(yǎng)皿上，燈芯浸入溶劑中，將另一同樣大小培養(yǎng)皿反蓋上，可見(jiàn)溶劑沿?zé)粜旧仙綖V紙，在向四周擴(kuò)散，約25min后，溶劑前緣距濾紙邊緣約1cm時(shí)即可取出，在60℃烘箱中烤干。

4.顯色：將上述濾紙平放在培養(yǎng)皿上，噴上0.5%茚三酮溶液，使濾紙全部潤(rùn)濕再在60℃烘箱干燥之，此時(shí)可見(jiàn)紫色斑出現(xiàn)，比較色斑的位置及色澤深淺，計(jì)算Rf值，分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。

（四）注意事項(xiàng)

第一，操作中接觸濾紙前要洗手擦凈，并盡量避免手與濾紙中間部位接觸。

第二，點(diǎn)樣點(diǎn)不宜過(guò)大，直徑小于0.5cm。

（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

顯色數(shù)天后，發(fā)現(xiàn)顯色條帶繼續(xù)擴(kuò)散，1號(hào)位中間原本清晰的條帶已經(jīng)模糊了，且丙氨酸的顯色條帶脫色嚴(yán)重。

三、討論分析

（一）確定測(cè)定管成分

由式（1）可得實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各色斑Rf計(jì)算值如表4。

由上表可得，故對(duì)照組中應(yīng)為丙氨酸顯色，測(cè)定管兩色斑中Rf值分別與丙氨酸和谷氨酸相近，故測(cè)定管距原點(diǎn)較遠(yuǎn)的顯色帶應(yīng)為丙氨酸，距原點(diǎn)較近的顯色帶應(yīng)為谷氨酸。

進(jìn)一步分析，測(cè)定管是在37肝勻漿加入丙氨酸，而肝勻漿中的轉(zhuǎn)氨酶能將丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移至-酮戊二酸，生成谷氨酸，當(dāng)反應(yīng)終止時(shí)，丙氨酸并未完全反應(yīng)，故測(cè)定管中顯色帶有兩條，分別為丙氨酸與谷氨酸。由于谷氨酸的側(cè)鏈為-COOH，增大了氨基酸的極性，使其在水中分配系數(shù)較大，更傾向于與固定相結(jié)合，故移動(dòng)程度不大，Rf值較??；丙氨酸的側(cè)鏈為-CH3，疏水親脂，所以在流動(dòng)向中分配系數(shù)較大，更容易隨流動(dòng)相往前移動(dòng)，Rf值比谷氨酸大。

（二）異?，F(xiàn)象探討及改進(jìn)建議

1.顯色帶異常蝴蝶狀現(xiàn)象。由表1中實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可見(jiàn)，該實(shí)驗(yàn)所得5條顯色帶均為蝴蝶狀，而非正常弧形，這會(huì)給實(shí)驗(yàn)Rf值的確定帶來(lái)誤差。由圖不難發(fā)現(xiàn)，每條顯色帶向外伸出部分均位于圓形濾紙折痕處，故筆者分析，是由于濾紙中折痕的存在影響了固定相及流動(dòng)相在濾紙上流動(dòng)的速度，造成折痕處與周圍處液相流動(dòng)不均，使顯色帶呈蝴蝶狀。由此可推測(cè)，在該創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，濾紙應(yīng)平整無(wú)折痕，以避免造成實(shí)驗(yàn)Rf值測(cè)定出現(xiàn)誤差。

2.顯色后條帶擴(kuò)散現(xiàn)象。由表2中圖可對(duì)比得：在加入顯色劑后，顯色帶仍在緩慢擴(kuò)散，以致最開始測(cè)定組中清晰白色間隔消失。實(shí)驗(yàn)證明，在顯色后一段時(shí)間內(nèi)，繼續(xù)擴(kuò)散現(xiàn)象尤為明顯，常導(dǎo)致測(cè)定組的兩條顯色帶融為一條，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不明顯，且影響Rf值的測(cè)定。

筆者分析，該實(shí)驗(yàn)的顯色劑為茚三酮，在顯色時(shí)，加入的茚三酮與水混合，不易揮發(fā)，在整個(gè)圓形濾紙上均有殘留，但分離后的顯色帶會(huì)繼續(xù)隨著溶劑的蒸發(fā)而擴(kuò)散，擴(kuò)散過(guò)程中與殘留在濾紙上的茚三酮反應(yīng)，導(dǎo)致顯色條帶移動(dòng)擴(kuò)大。

故，做該紙層析實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇的顯色劑應(yīng)盡量與水不混合且揮發(fā)性大，若顯色劑無(wú)法滿足上述條件，則應(yīng)在顯色之后立即測(cè)定Rf相關(guān)參數(shù)，并照相記錄或加入相應(yīng)穩(wěn)定劑保存。

3.拖尾現(xiàn)象。由表3可見(jiàn)，對(duì)比組存在明顯拖尾現(xiàn)象，而拖尾是紙層析中經(jīng)常出現(xiàn)的現(xiàn)象。造成拖尾的原因眾多，最主要的原因可能有點(diǎn)樣量過(guò)大、展開劑不合適、展開溫度不適、展開濕度不適等。筆者將點(diǎn)樣量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響做了進(jìn)一步分析，具體分析如下。

筆者在另一濾紙上滴了不同量的丙氨酸（均是每一滴晾干之后再滴下一滴）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5。

同理，可計(jì)算該補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)各顯色帶Rf值。

由上兩表可得，在本次實(shí)驗(yàn)中，丙氨酸用量在1—4滴范圍內(nèi)（保證每次點(diǎn)樣直徑小于0.5cm），均未出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，同時(shí)也通過(guò)計(jì)算不同用量色斑Rf值可得Rf值與溶劑用量無(wú)關(guān)。

通過(guò)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，筆者認(rèn)為，可以排除在點(diǎn)樣1—4滴內(nèi)，點(diǎn)樣用量對(duì)丙氨酸色斑造成拖尾現(xiàn)象的影響，故推測(cè)造成丙氨酸拖尾的原因更有可能是點(diǎn)樣直徑過(guò)大，或展開劑配比未達(dá)要求，展開劑未飽和等，但具體這些因素如何對(duì)色斑移動(dòng)產(chǎn)生影響，以及這些因素對(duì)谷氨酸色斑產(chǎn)生的影響是否與丙氨酸相同等問(wèn)題都有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。在這些因素的具體影響未明了的情況下，實(shí)驗(yàn)者點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)尤其注意樣點(diǎn)直徑，按照實(shí)驗(yàn)要求配置溶液，并待展開劑飽和展開裝置后再展開。

四、結(jié)語(yǔ)

綜上所述，運(yùn)用以流動(dòng)液體為固定相的紙層析法分離氨基酸能極大地提高實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)便性，能簡(jiǎn)單有效地實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離，但分離過(guò)程中應(yīng)注意細(xì)節(jié)，如保證濾紙的平整、選取適當(dāng)顯色劑、顯色之后立刻拍照保存、控制點(diǎn)樣直徑、把握展開劑配比等，以提高實(shí)驗(yàn)的可行性與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說(shuō)服力。

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