L-異亮氨酸高產(chǎn)菌選育及其培養(yǎng)基優(yōu)化

王壯壯 魏佳 于海波 徐建中 張偉國

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

L-異亮氨酸，別名L-異白氨酸，是人體八種必需氨基酸之一。1901年，F(xiàn)ischer從蛋白水解液中發(fā)現(xiàn)L-異亮氨酸，是對于異亮氨酸最早的報道［1］。L-異亮氨酸廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化妝品與醫(yī)藥行業(yè)［2］。目前，國內(nèi)外采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-異亮氨酸，然而生產(chǎn)菌株存在產(chǎn)酸率低，雜酸較多等問題。因此，選育一株產(chǎn)酸率高，雜酸含量低的L-異亮氨酸產(chǎn)生菌對工業(yè)化生產(chǎn)L-異亮氨酸具有重要意義。

目前應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株主要是通過傳統(tǒng)誘變獲得，Yoshinaga［3］等通過選育S-2氨基乙基-L-半胱氨酸抗性（AECr）、α-氨基 -β-羥基戊酸抗性（AHVr）、乙硫氨酸抗性（Ethr）的多重抗性菌株，發(fā)酵過程中流加硫酸銨和醋酸混合液，可產(chǎn)L-異亮氨酸37.4 g/L。Ikeda等［4］以蘇氨酸產(chǎn)生菌FAB-3-1為出發(fā)菌株選育Ethr突變株，獲得突變株No.14083，流加乙酸發(fā)酵，可產(chǎn)L-異亮氨酸33.5 g/L。謝飛等［5］以谷氨酸棒狀桿菌為出發(fā)菌株，利用低能氮離子束注入對其進行多次誘變，結(jié)合異亮氨酸氧肟酸鹽（IleHx）等氨基酸結(jié)構(gòu)類似物定向篩選，得到一株穩(wěn)定的高產(chǎn)L-異亮氨酸菌株，搖瓶培養(yǎng)72 h產(chǎn)酸可達21-22 g/L。陳寧［6］等以黃色短桿菌為出發(fā)菌株，誘變篩選出一株具有α-氨基丁酸（α-AB）抗性、蛋氨酸缺陷型（Met—）、AECr、Ethr菌株 TC-1，10 L發(fā)酵罐84 h可產(chǎn)酸25.0 g/L。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展成熟，分子手段也被應(yīng)用于菌中選育，但是目前誘變育種仍是工業(yè)菌種選育最為有效的手段。常壓室溫等離子體生物誘變體系（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）作為一種新興的高效生物突變手段，具有放電均勻、活性粒子濃度高、化學(xué)活性物種可調(diào)控性好、操作簡單、安全性高、環(huán)境友好、突變速度快、突變率高、突變多樣性大等特點［7］，被廣泛應(yīng)用于菌中選育。本文前期采用硫酸二乙酯對菌株進行常規(guī)化學(xué)誘變處理，后期結(jié)合了更加安全和更加穩(wěn)定的ARTP對菌種進行逐級誘變，獲得一株2-噻唑丙氨酸（2-TA）和磺胺胍（Sulfaguanidine，SG）高抗性和在琥珀酸平板上能快速生長的突變菌株B. flavumTA-6。隨后，為達到誘變后菌株最佳產(chǎn)酸水平，本實驗采用響應(yīng)面法對該突變菌株培養(yǎng)基組分進行了進一步優(yōu)化控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株Brevibacterium flavumI-12，由本實驗室提供，保藏于-80℃冰箱甘油管中。

1.1.2 主要試劑和儀器 琥珀酸鈉，硫酸二乙酯，硫代硫酸鈉，國藥集團（上海）有限公司；2-噻唑丙氨酸（2-TA），磺胺胍，德國Sigma公司。

HYL-B全溫搖瓶柜，太倉市強樂實驗有限責(zé)任公司；常壓室溫等離子體生物誘變系統(tǒng)，無錫源清天木生物科技有限公司；ST16型離心機，美國賽默飛世爾科技有限公司；721N可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 完全培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖5.0，NaCl 5.0，蛋白胨10.0，牛肉浸膏10.0，瓊脂20.0，pH 7.0。

珀酸培養(yǎng)基（SAM；g/L）：琥珀酸鈉 50.0，（NH4）2SO43.0，尿素 1.5，KH2PO41.0，K2HPO43.0，MgSO4·7H2O 0.1，MnSO4·4H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，硫胺素 100 μg/L，生物素 30 μg/L，瓊脂 20.0，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 25.0，（NH4）2SO4（工業(yè)級）5.0，玉米漿 40.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO310.0，pH 7.5。

發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基（g/L）：葡 萄 糖 130.0，（NH4）2SO4（ 工 業(yè) 級 ）30.0， 玉 米 漿 12.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.05， 生 物 素 50 μg/L，CaCO330.0，pH 7.5。

完全培養(yǎng)基、琥珀酸培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，0.1 MPa條件下滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基0.07 Mpa條件下滅菌10 min。

1.2 方法

1.2.1 誘變方法

1.2.1.1 硫酸二乙酯誘變 刮取3-5環(huán)菌于裝有玻璃珠和10 mL生理鹽水的小三角瓶中，加入20 μL硫酸二乙酯和1 mL無水乙醇振蕩10 min，加入1 mL 25%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，6 000 r/min離心后生理鹽水洗滌兩次，重懸菌體，涂布于篩選培養(yǎng)基，倒置、30℃培養(yǎng)2-3 d，挑選抗性菌株。DES屬于烷化劑，主要原理是烷化劑的活性烷基可以轉(zhuǎn)移到其他分子中電子密度高的地方去，并能夠輕而易舉取代DNA分子中活潑的氫原子，使得DNA分子上的一個或多個堿基及磷酸部分被烷基化，進而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，使其堿基互補配對時發(fā)生錯配而造成突變［8］。結(jié)合相關(guān)文獻［9-10］，致死率在90%左右正突變率較高。

1.2.1.2 ARTP誘變 首先取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液，離心后用生理鹽水重懸菌體，控制OD562=0.5-0.6，取10 μL菌懸液均勻涂到無菌的載片上，然后用ARTP進行處理，通過處理時間控制致死率。誘變結(jié)束后將載片放入盛有1 mL無菌生理鹽水的EP管中，于振蕩器上震蕩1 min，使誘變后的菌體充分洗脫下來，然后稀釋合適倍數(shù)，涂布于相應(yīng)抗性平板挑選抗性菌落。ARTP誘變條件：射頻功率100 W，載氣流量10 SLM，處理距離2 mm，處理時間20-160 s。根據(jù)相關(guān)文獻［11-13］，離子束處理致死率在90%時可獲得較高正突變率。

1.2.2 高產(chǎn)菌篩選方法

1.2.2.1 平板初篩 分別取誘變后的菌液200 μL涂布于SAM培養(yǎng)基、2-TA和SG抗性平板，恒溫30℃、倒置培養(yǎng)2-3 d，挑選生長快速、單菌落較大的菌株轉(zhuǎn)接于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2 d，進行搖瓶初篩。

1.2.2.2 搖瓶初篩 將抗性平板挑出的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床30℃、100 r/min培養(yǎng)72 h，取靜置后的發(fā)酵上清液測定產(chǎn)量，初步篩選L-異亮氨酸高產(chǎn)菌。

1.2.2.3 搖瓶復(fù)篩 將搖瓶初篩篩選出的高產(chǎn)菌平板活化后接種于種子培養(yǎng)基，搖床30℃、100 r/min培養(yǎng)16-18 h后，轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基（每株3個平行），搖床30℃、100 r/min培養(yǎng)72 h，取靜置后的上清發(fā)酵液，用高效液相色譜精確測定L-異亮氨酸產(chǎn)量及雜酸產(chǎn)量，將高產(chǎn)菌編號并用甘油管保存，作為下一步誘變的出發(fā)菌株。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 菌體濃度測定 取發(fā)酵液200 μL，用0.25 mol/L的稀鹽酸稀釋26倍，測定562 nm處吸光度值。

1.2.3.2 致死率 致死率（%）=（對照組活菌數(shù)-誘變組活菌數(shù)）×100% /對照組活菌數(shù)

1.2.3.3 葡萄糖含量的測定 發(fā)酵液稀釋100倍，離心去除菌體和碳酸鈣后，利用SBA-40E生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中葡萄糖含量，每次進液量為25 μL。

1.2.3.4 L-異亮氨酸的測定 高效液相色譜法［14，15］：高效液相色譜法：取800 μL發(fā)酵液，8 000 r/min離心3 min去除菌體，經(jīng)孔徑0.22 μm的濾膜過濾所得濾液，用高效液相色譜Agilent 1200分析測定其中L-異亮氨酸含量。色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA；檢測器：DAD檢測器；流動相：流動相A，5 mL/L四氫呋喃，5 g/L無水乙酸鈉，200 μg/L三乙胺，冰醋酸調(diào)pH至7.2；流動相B，25 g/L無水乙酸鈉∶甲醇∶乙腈=1∶2∶2；色譜條件：柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進樣體積10.0 μL，波長338 nm。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化L-異亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基

1.2.4.1 Plackett-Burman實驗設(shè)計 據(jù)馬雷等［16］文獻報道，發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉可有效減少副產(chǎn)物的生成，所以在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取原始培養(yǎng)基中的7個組分以及檸檬酸鈉共8個組分進行PB試驗設(shè)計。通過N=12的Plackett-Burman設(shè)計，將L-異亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基8個組分對L-異亮氨酸生產(chǎn)影響的顯著性進行了考察，共12組實驗，每組3個平行，重復(fù)試驗 4次，具體實驗設(shè)計見表1。

表1 實驗因素水平的選擇

1.2.4.2 Box-Behnken實驗設(shè)計 在Plackett-Burman試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4這3個對L-異亮氨酸產(chǎn)量有顯著影響的因素做出3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計，實驗因素水平選擇見表2，具體實驗設(shè)計見表5，共17組實驗組，其中包括5組中心點實驗，每組3個平行，重復(fù)試驗4次。其它培養(yǎng)基組分濃度與Plackett-Burman試驗設(shè)計第5組中培養(yǎng)基添加量保持一致。

表2 Box-Behnkne實驗因素水平

2 結(jié)果

2.1 誘變致死曲線的測定

2.1.1 DES誘變致死曲線 根據(jù)方法1.2.1.1對出發(fā)菌株進行誘變，以DES濃度為變量，測定DES誘變致死曲線，如圖1所示，DES濃度為2.0 mL/L時，致死率為88.65%，濃度達到2.5 mL/L時，菌體致死率接近百分之百。致死率在90%左右正突變率較高，故本實驗選擇2.0 mL/L DES進行化學(xué)誘變。

圖1 DES誘變致死曲線

2.1.2 ARTP誘變致死曲線 ARTP對微生物作用的主要因子為高濃度的中性活性粒子。而且相對于其他傳統(tǒng)誘變技術(shù)，ARTP誘變育種技術(shù)的顯著特點是：操作簡便、設(shè)備簡單、條件溫和、安全性高、誘變快速、突變率高、突變庫容大。

根據(jù)方法1.2.1.2對原始菌株進行ARTP誘變，以離子束處理時間為變量，測定ARTP誘變致死曲線，如圖2所示。在照射時間為100 s時，致死率達到94.35%，120 s時菌體基本全部死亡，離子束處理致死率在90%可獲得較高正突變率。故本實驗確定最佳誘變時間為100 s。

圖2 ARTP誘變致死曲線

2.2 突變株B. flavum TA-6選育譜系及遺傳穩(wěn)定性實驗

經(jīng)過一系列復(fù)合誘變及抗性篩選，最終得到一株L-異亮氨酸產(chǎn)量達到26.2 g/L高產(chǎn)突變株B.flavumTA-6，比出發(fā)菌株提高了44.75%，其選育譜系如圖3所示。其篩選機理為：琥珀酸培養(yǎng)基篩選磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶高酶活突變株，增強CO2固定能力，增加天冬氨酸合成。2-TA是L-亮氨酸和L-纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，篩選2-TA抗性菌株，可以解除乙酰羥基酸合酶受到的反饋抑制和阻遏。此外，選育SG抗性解除了天冬氨酸對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制，使代謝更加流暢。

圖3 B. flavum TA-6選育譜系

誘變育種是選育高產(chǎn)菌株較為有效的方法，但也存在突變體遺傳不穩(wěn)定的問題，所以對高產(chǎn)菌進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，檢驗突變株的遺傳穩(wěn)定性也十分必要。為檢驗B.flavumTA-6的遺傳穩(wěn)定性，對其進行7代連續(xù)發(fā)酵實驗，結(jié)果（圖4）表明B.flavumTA-6具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 突變株TA-6遺傳穩(wěn)定性

2.3 搖瓶發(fā)酵過程產(chǎn)酸曲線

為了對比誘變前后L-異亮氨酸及主要雜酸產(chǎn)量變化，對搖瓶發(fā)酵過程中主要氨基酸的產(chǎn)量變化進行了監(jiān)測，發(fā)酵72 h（測定至78 h），每6 h取樣一次。結(jié)果（圖5）顯示，突變菌株B.flavumTA-6產(chǎn)酸由突變前18.1 ± 0.5 g/L提高至26.2 ± 0.5 g/L，提高了44.75%，主要的雜酸L-亮氨酸由2.10 ± 0.15 g/L下降為1.02 ± 0.06 g/L，L-纈氨酸由4.62 ± 0.30 g/L下降至 2.42 ± 0.04 g/L。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化L-異亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基

2.4.1 Plackett-Burman實驗 在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化方面，響應(yīng)面法被廣泛應(yīng)用，而且效果較為顯著。對本實驗而言，一方面是因為菌株發(fā)生了突變，原始培養(yǎng)基可能并不是最合適的產(chǎn)酸培養(yǎng)基，所以對原始培養(yǎng)基進行重新優(yōu)化是很有必要的。另一方面，發(fā)酵過程中添加檸檬酸鈉可有效減少副產(chǎn)物的生成，提高L-異亮氨酸生物合成途徑的代謝流量。所以在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取原始培養(yǎng)基中的7個組分以及檸檬酸鈉共8個組分進行PB試驗設(shè)計。初步篩選出對于L-異亮氨酸產(chǎn)量有顯著影響的因素，具體的實驗結(jié)果見表3。

圖5 搖瓶發(fā)酵過程產(chǎn)酸曲線

表3 N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計響應(yīng)值

通過Design expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，方差分析結(jié)果如表4所示。由表可知主效應(yīng)P值為0.044 9，小于0.05表明Plackett-Burman實驗設(shè)計的因素所選取水平對L-異亮氨酸產(chǎn)量影響顯著，同時決定系數(shù)R2為0.9623%，說明回歸模型有效，實驗設(shè)計合理，結(jié)果可靠。因素所對應(yīng)的P值越小，說明該因素對異亮氨酸產(chǎn)量影響越大，各因素對異亮氨酸產(chǎn)量影響大小排序為葡萄糖（P=0.010 4）＞KH2PO4（P=0.042 3）＞（NH4）2SO4（P=0.045 4）＞ 玉米漿（P=0.108 4）＞檸檬酸鈉（P=0.227 5）＞ 碳酸鈣（P=0.294 0）＞ MgSO4·7H2O（P=0.457 2）＞ 生物素（P=0.936 1）。因此，選取葡萄糖、KH2PO4、（NH4）2SO4為L-異亮氨酸產(chǎn)量的主要影響因素。

基于上述結(jié)果，在后續(xù)的實驗設(shè)計中，將圍繞葡萄糖、KH2PO4、（NH4）2SO4三個因素進行重點考察，優(yōu)化出其最佳添加水平。此外，基于單因素實驗優(yōu)化結(jié)果可知，其他因素最佳添加水平如下（g/L）：玉米漿18.0，MgSO4·7H2O 0.1，檸檬酸鈉1.0，碳酸鈣30.0，生物素1.5×10-4。

表4 回歸模型的方差分析

2.4.2 Box-Behnken實驗結(jié)果 Box-Behnken的實驗設(shè)計和結(jié)果見表5，采用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，根據(jù)分析結(jié)果，整理可得L-異亮氨酸產(chǎn)量對葡萄糖、（NH4）2SO4、K2HPO43個因素的二次回歸方程：Y=25.92-0.89A+1.11B+0.80C-0.23AB-0.60AC-0.70BC-0.17A2-0.62B2-1.6C2?；貧w方程的方差分析和模型顯著性分析的結(jié)果，如表6所示。

由表6可知，模型P值小于0.001，表明本實驗所選用的二次多項模型顯著，試驗方法合理，實驗結(jié)果可靠。Adeq Precision的值應(yīng)大于4，本實驗等于24.77，說明這個模型有足夠分辨力，能合適地反映實驗結(jié)果；變異系數(shù)（C.V.值1.33）低于10，說明實驗有良好的穩(wěn)定性；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.980 5，說明響應(yīng)值的變化有98.05%來源于所選因素，僅有約1.85%的響應(yīng)值總變異不能由此模型進行解釋，未知因素對實驗結(jié)果的干擾較??；預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2值（Pred R-Squared 0.831 2）與調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2值（Adj R-Squared 0.955 3）相比是合理一致的，這意味著該回歸模型對因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系做了很好的解釋。此外，模型一次項A、B、C和二次項C2差異極顯著，且一次項顯著程度B＞A＞C，說明L-異亮氨酸發(fā)酵需要更多的氮源。交互項AC、BC和二次項B2差異顯著，說明所選因素對L-異亮氨酸的產(chǎn)量影響存在更為復(fù)雜的交互關(guān)系，而不僅僅是簡單的線性關(guān)系。綜上表明模型的擬合程度很好，誤差較小，可信度高，此模型可以用來優(yōu)化L-異亮氨酸最適的培養(yǎng)基組成。

表5 Box-Behnkne實驗設(shè)計及結(jié)果

對二次方程求解，得出優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖140.0，硫酸銨39.44，玉米漿18.0，K2HPO41.12，MgSO4·7H2O 0.1，檸檬酸鈉 1.0，碳酸鈣30.0，生物素1.5×10-4。

2.4.3 驗證試驗 利用Design-Expert軟件分析得到的L-異亮氨酸最佳發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖140.0，硫酸銨 39.44，玉米漿 18.0，K2HPO41.12，MgSO4·7H2O 0.1，檸檬酸鈉1.0，碳酸鈣30.0，生物素1.5×10-4（圖6）。以其為標準配制培養(yǎng)基，其他條件保持穩(wěn)定，進行搖瓶發(fā)酵實驗驗證此模型的準確性。實驗結(jié)果測得L-異亮氨酸的產(chǎn)量為27.8 g/L，比優(yōu)化前提高了6.1%，與理論預(yù)測值接近，證明了該模型對于L-異亮氨酸產(chǎn)量預(yù)測的準確性。

3 討論

本實驗主要通過化學(xué)誘變結(jié)合常壓室溫等離子體生物誘變體系，逐級誘變選育L-異亮氨酸高產(chǎn)菌。經(jīng)過一系列誘變和篩選，成功選育出一株在40 g/L的2-TA和5 g/L的SG，且以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上快速生長突變株B.flavumTA-6，該菌株搖瓶發(fā)酵情況下產(chǎn)酸水平達26.2 g/L，比誘變前提高了44.75%。此外，該菌株分泌的3種主要的副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸的積累量明顯減少，其中L-纈氨酸和L-亮氨酸減少的更為顯著。遺傳穩(wěn)定性實驗表明，誘變選育出的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌B.flavumTA-6具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可以用于工業(yè)化生產(chǎn)。最后，在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對B. flavumTA-6發(fā)酵培養(yǎng)基進了進一步優(yōu)化控制，得出最佳培養(yǎng)及配方為（g/L）：葡萄糖140.0，硫酸銨 39.44，玉米漿 18.0，K2HPO41.12，MgSO4·7H2O 0.1，檸檬酸鈉1.0，碳酸鈣30.0，生物素1.5×10-4。在該優(yōu)化條件下，B. flavumTA-6最終L-異亮氨酸產(chǎn)量達27.8 g/L，比優(yōu)化前提高了6.1%。除了以上3個主要影響因素，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，生物素也比優(yōu)化前添加的更多，其原因是生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，生物素含量高有利于丙酮酸的羧化反應(yīng)，有利于增加天冬氨酸族氨基酸產(chǎn)量［5］。此外，選育SG抗性解除了天冬氨酸對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制，不僅使代謝更加流暢。SG還是四氫葉酸的抗代謝物，而四氫葉酸是葉酸的衍生物，它是一碳化合物的載體，以輔酶的形式參與蛋白質(zhì)和核酸代謝過程，對甲基的轉(zhuǎn)移、甲酸基和甲醛基的利用起重要作用［6］。

表6 回歸模型的方差分析及系數(shù)顯著性檢驗

圖6 葡萄糖、硫酸銨和KH2PO4交互影響L-異亮氨酸產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

在基因工程育種方面，Guillouet等［17］在谷氨酸棒桿菌中過表達對反饋不敏感高絲氨酸脫氫酶（homdr）、高絲氨酸激酶（thrB）和分解代謝蘇氨酸脫水酶（tdcB），改造后的菌株可產(chǎn)L-異亮氨酸8.8 g/L。Sahm等［18］通過在L-賴氨酸高產(chǎn)菌中擴增對反饋抑制不敏感的高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶使得碳流從中間體L-天冬氨酸半醛轉(zhuǎn)向高絲氨酸，并過表達反饋抑制不敏感的蘇氨酸脫水酶，分批發(fā)酵可產(chǎn)L-異亮氨酸30 g/L。國內(nèi)研究人員在代謝工程選育L-異亮氨酸高產(chǎn)菌方面的研究也有較好的進展，如Yin和王小元等［19］在L-異亮氨酸高產(chǎn)菌中串聯(lián)表達TDFbr和AHASFbr基因，發(fā)酵可產(chǎn)L-異亮氨酸30.7 g/L；徐慶陽等［20］通過將hom基因與表達載體pXMJ19連接構(gòu)建出重組質(zhì)粒pXMJ19-hom，再轉(zhuǎn)入C. glutamicumYILW構(gòu)建C.glutamicumYILW（pXMJ19-hom），5 L罐可產(chǎn) L-異亮氨酸 36.5 g/L，是目前產(chǎn)量較高的報道。需要指出的是，利用分子改造選育的高產(chǎn)菌也存在一定局限性，如需要添加抗生素來防止質(zhì)粒丟失，不僅增加了發(fā)酵成本，而且容易造成抗生素污染影響正常發(fā)酵［21］。

對于突變株B.flavumTA-6 產(chǎn)酸提高的具體原因目前還不清楚，還需對關(guān)鍵酶基因如ilvBN和ppc進行進一步分析才能得出結(jié)論。此外，搖瓶條件下的溶氧、pH調(diào)控水平有限，且過高糖濃度也會影響菌體生長，因此，需要在分批發(fā)酵過程中進一步優(yōu)化控制發(fā)酵工藝，提高L-異亮氨酸產(chǎn)量。

4 結(jié)論

通過傳統(tǒng)化學(xué)誘變結(jié)合ARTP生物誘變體系，成功選育出一株雜酸降低的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌B.flavumTA-6。該菌株可在40 g/L的2-TA和5 g/L的磺胺胍，且以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上快速生長，在搖瓶發(fā)酵過程中L-異亮氨酸產(chǎn)量達26.2±0.5 g/L，比出發(fā)菌株提高了44.75%，而副產(chǎn)物L(fēng)-纈氨酸和L-亮氨酸積累量明顯降低。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件后，突變株產(chǎn)酸可達27.8±0.5 g/L，比優(yōu)化前提高了6.1%。綜上所述，菌株B.flavumTA-6具有潛在工業(yè)化生產(chǎn)L-異亮氨酸的應(yīng)用價值。