基于微流控技術(shù)的外泌體分離方法的研究進(jìn)展

劉娜 杜盼盼 楊揚(yáng) 李小毛

（上海大學(xué)機(jī)電工程與自動(dòng)化學(xué)院，上海 200072）

外泌體是一種細(xì)胞內(nèi)多泡小體與細(xì)胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細(xì)胞外的一種囊泡，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，直徑一般為30-150 nm，與其他微泡共同組成細(xì)胞外囊泡［1］。近幾年來的研究表明外泌體具有功能活性并可進(jìn)行細(xì)胞間的信息傳遞，并且在抗原傳遞、蛋白及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、血管介導(dǎo)新生、腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要作用［2-4］。此外，由于外泌體具有體積小、易穿透生物膜、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥物的良好載體［5］。而且腫瘤細(xì)胞的外泌體中含有大量與腫瘤相關(guān)的mRNA、miRNA、rRNA、DNA及特異性蛋白質(zhì)［4］，因此在癌癥發(fā)生機(jī)制及癌癥的早期檢測(cè)中具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。例如，Tanaka等［6］研究表明miRNA水平與腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展以及侵襲性密切有關(guān)，Kalluri和Taylor等［7-8］發(fā)現(xiàn)癌癥患者中的病變器官和其中的異常細(xì)胞會(huì)比正常細(xì)胞產(chǎn)生更多的外泌體。

盡管外泌體在血液、尿液、乳液和唾液等體液中含量豐富［9］，但是體液中其他種類的細(xì)胞外囊泡及生物分子往往會(huì)對(duì)其研究結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此對(duì)外泌體的分離和純化是基于外泌體的疾病檢測(cè)及相關(guān)研究的重要環(huán)節(jié)。然而，外泌體具有尺寸小、密度低以及生物流體性復(fù)雜等特點(diǎn)，這對(duì)外泌體的分離和純化提出了重大的挑戰(zhàn)。近幾年來，圍繞癌癥等疾病的研究及診斷應(yīng)用，已有大量針對(duì)外泌體分離和純化的方法技術(shù)研究。本文首先簡(jiǎn)要介紹傳統(tǒng)的外泌體分離方法如離心法和過濾法等，然后重點(diǎn)介紹近年來利用聲流特性、流體動(dòng)力學(xué)特性以及介電泳特性等基于微流控技術(shù)的外泌體分離方法。本文通過歸納比較當(dāng)前已有的外泌體分離純化方法，旨在為要開展外泌體研究的研究人員提供參考， 推進(jìn)外泌體在相關(guān)疾病檢測(cè)及其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的研究進(jìn)展。

1 傳統(tǒng)的外泌體分離方法

傳統(tǒng)的外泌體分離的方法，較為常用的有基于離心、過濾、免疫磁珠以及聚合物沉淀的方法。

超速離心法是目前傳統(tǒng)外泌體分離技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法。其原理主要是基于相對(duì)離心力的不同依次去除血液中的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)，最后分離純化得到外泌體。基于超速離心法的原理，大量改進(jìn)的外泌體分泌方法被相繼報(bào)道。例如，邢宇洋等［10］采用多步差速離心的方法分離了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的外泌體，并從形態(tài)學(xué)、蛋白標(biāo)記物和miRNA等方面對(duì)其進(jìn)行了鑒定，進(jìn)一步證實(shí)了多步差速離心方法是一種簡(jiǎn)單有效的外泌體提取方法。陳加貴等［11］采用改良的超速離心法實(shí)現(xiàn)了肝癌細(xì)胞外泌體的分離和純化，首先收集使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的上清液，然后在3 kg下離心去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，然后依次在110 kg下離心3次獲得外泌體。這種改良后的超速離心方法能提取到一定純度的外泌體，并且能夠排除來自細(xì)胞培養(yǎng)血清所含的外泌體的干擾。為了進(jìn)一步改善超速離心法分離外泌體的純度，研究者提出了利用蔗糖密度梯度的外泌體離心法，這種方法是將樣本和蔗糖梯度材料一起超速離心，使樣品中不同組分沉降到各自的等密度區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)外泌體的分離［12］。

盡管超速離心法在外泌體的分離中得到了廣泛的應(yīng)用，但其對(duì)離心速度的苛刻要求以及較低的分離產(chǎn)量制約了其發(fā)展，為此相關(guān)學(xué)者提出了基于過濾的分離方法，如旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)。旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)分離外泌體的原理是利用超濾膜孔徑的大小對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)進(jìn)行分離。胡國(guó)文等［13］采用了一種利用旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）培 養(yǎng) 上 清液中分離外泌體的方法。首先收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，在低速離心下去除殘余的細(xì)胞，然后用0.22 μm的過濾器去除細(xì)胞碎片，最后采用旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)成功分離外泌體。相對(duì)于超速離心法所需要的大于100 kg的離心力，這種方法僅需要517.125 kPa的壓力，可有效減少離心力對(duì)外泌體的損壞，并且可以提高外泌體的分離產(chǎn)量。然而，該方法中的缺點(diǎn)為過濾膜孔徑會(huì)對(duì)分離結(jié)果產(chǎn)生影響，Liu等［14］就發(fā)現(xiàn)使用30 nm和50 nm孔徑分離得到的外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)并不完全相同，這可能會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的外泌體蛋白質(zhì)分析和檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生差異。

外泌體表面含有CD9、CD63、CD81等特異性蛋白，因此可以利用這些特異性表面蛋白實(shí)現(xiàn)外泌體的分離和收集。免疫磁珠法就是一種通過抗體結(jié)合磁珠實(shí)現(xiàn)特異性捕獲外泌體的方法［15］，該方法不僅可以增加外泌體的分離純度，還可以通過結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡以及電子顯微鏡等方法對(duì)收集的外泌體進(jìn)行分析。

另外，聚合物沉淀的方法也被用于分離外泌體。聚合物沉淀法是利用聚合物作為沉淀劑從生物樣本中分離沉降出外泌體，如基于聚乙二醇的沉淀方法的原理就是含水的聚乙二醇可以包裹外泌體形成外泌體聚合物，進(jìn)而在低速離心中就可以輕松分離。Weng等［16］根據(jù)這個(gè)原理從海拉細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離出外泌體，并且研究了聚乙二醇的分子量MW和濃度對(duì)外泌體分離效果的影響。類似的，可以采用這種方法從血液、尿液、唾液等生物樣本中分離和純化外泌體。但是，這種方法提取的外泌體可能會(huì)受到聚合物和一些蛋白質(zhì)的污染，從而對(duì)后續(xù)的功能性分析產(chǎn)生影響。

2 基于微流控技術(shù)的分離方法

雖然傳統(tǒng)的外泌體分離方法比較常用，但是存在所需樣本量大、可能損傷外泌體以及回收率低等缺點(diǎn)。近年來，隨著微納米制造工藝的發(fā)展，微流控技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種微粒分離及檢測(cè)過程?；谖⒘骺丶夹g(shù)的分離檢測(cè)具有所需樣本小、檢測(cè)速度快及檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此一些研究人員在微流控技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合聲波、介電電泳、微流體黏彈性以及其他物理特性成功發(fā)展了多種新穎的外泌體分離方法。

2.1 聲流體技術(shù)分離外泌體

研究人員將微流控技術(shù)和聲學(xué)巧妙地結(jié)合形成聲流體（Acoustofluidics），可有效實(shí)現(xiàn)細(xì)胞等微粒的分選和操縱，其原理是不同尺寸的微粒在微流控聲場(chǎng)中會(huì)受到差異化大小的聲輻射力和粘滯力［17-19］。其中，粘滯力與微粒的半徑成正比，而聲輻射力與微粒的體積成正比。如圖1-A-B所示，對(duì)于尺寸較大的微粒，聲輻射力起主導(dǎo)作用，微粒向聲波節(jié)點(diǎn)移動(dòng)；而尺寸較小的粒子，黏滯力抵消了大部分的聲輻射力，微粒側(cè)向運(yùn)動(dòng)微弱。在聲輻射力和黏滯力的綜合作用下，尺寸不同的微粒會(huì)移向不同的出口，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)微粒的分離。雖然聲流體技術(shù)在細(xì)胞操縱和分離中得到了廣泛的應(yīng)用，但最初的聲流體器件只適合兩種目標(biāo)物的分離，因此很難從成分復(fù)雜血液中分離出外泌體。針對(duì)這種不足，Wu等［20］開發(fā)了一種新型的聲流體器件，可從全血樣品中以免標(biāo)記、無接觸的方式快速有效地分離出外泌體。該器件及分離過程如圖1-C所示，整體分為微細(xì)胞去除模塊和外泌體分離模塊。首先，在微細(xì)胞去除模塊中利用較低頻率（19.6 MHz）聲波去除血液中尺寸較大的紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及血小板等；然后在外泌體分離模塊中采用較高頻率（39.4 MHz）的聲波將外泌體與細(xì)胞外囊泡亞組成分（凋亡小體、較大的細(xì)胞外囊泡等）進(jìn)行分離，并在通道的指定出口對(duì)外泌體進(jìn)行收集。Lee等［21］也展示了一種基于聲波納米過濾系統(tǒng)的細(xì)胞外囊泡分離方法，該方法是根據(jù)細(xì)胞外囊泡和其他成分存在大小和密度差異，進(jìn)而可以利用超聲駐波將納米尺度的囊泡（＜200 nm）從細(xì)胞培養(yǎng)液和紅細(xì)胞產(chǎn)物中分離出來。

圖1 微流控技術(shù)結(jié)合聲波用于分離外泌體

基于聲流體的外泌體分離方法具有獲得的外泌體生物特性好、純度（～98%）和回收率（～82%）比較理想、所需樣本量少的優(yōu)點(diǎn)，是一種較為新穎的分離方法。但是其分離原理是根據(jù)對(duì)象尺寸和聲阻抗特性實(shí)現(xiàn)的，因此不可避免地會(huì)受到血漿中與外泌體尺寸和聲阻抗特性類似成分的干擾。

2.2 介電泳技術(shù)分離外泌體

在置于溶液中的微電極上施加交流電壓，常常會(huì)在電極表面產(chǎn)生電滲流、介電泳和電熱流等電液動(dòng)力現(xiàn)象，并且這些電液動(dòng)力現(xiàn)象可以通過控制交流電壓的頻率和幅值進(jìn)行靈活控制，因此被廣泛用于微流體的混合、微納顆粒的操控等應(yīng)用［22-24］。其中，交流電滲適合用于低電導(dǎo)率溶液的操作，這是因?yàn)楫?dāng)溶液電導(dǎo)率比較高時(shí)，在電極表面形成的雙電層厚度非常小，使得交流電滲的作用減弱［25］，難以實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞培養(yǎng)液或血清中分離外泌體。介電泳（Dielectrophoretic，DEP）力是介質(zhì)粒子在非均勻電場(chǎng)中受到極化并與電場(chǎng)相互作用產(chǎn)生的一種使極化粒子定向移動(dòng)的力。由于介電泳力的大小與被操縱粒子及溶液介質(zhì)的介電特性相關(guān)，并且與被操縱粒子的尺寸成比例［26］，要利用介電泳在血液中實(shí)現(xiàn)外泌體的分離和純化，需要設(shè)計(jì)特別的電極結(jié)構(gòu)。

Heineck等［27］通過比較平行導(dǎo)線排列和平面陣列，證實(shí)了平面陣列電極模型可以在高電導(dǎo)條件下不受電熱流的影響，這為從細(xì)胞培養(yǎng)液或血液等高電導(dǎo)溶液下分離外泌體提供了一種新的思路。Ibsen等［28］設(shè)計(jì)了一種基于介電泳技術(shù)的交流電動(dòng)微陣列芯片，能夠快速地從未稀釋的血液樣本中分離并且回收膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的外泌體。該芯片的分離原理是根據(jù)外泌體與血漿中其他成分具有不同的介電特性，因此會(huì)受到不同的介電泳力，使得納米尺度的外泌體被吸引到微電極邊緣區(qū)域，即介電泳強(qiáng)場(chǎng)區(qū)域，而細(xì)胞及大分子蛋白質(zhì)則被拉進(jìn)電極之間的介電泳弱場(chǎng)區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的分離。Sonnenberg等［29］采用類似的微陣列電極方法成功從血液中分離出DNA等納米尺度物質(zhì)。

采用介電泳技術(shù)分離外泌體回收率和純度高，而且所需的血漿樣本少（30-50 μL），在很短的時(shí)間內(nèi)（15 min）就能富集到外泌體［28］。但是該方法一個(gè)潛在的缺點(diǎn)就是外泌體可能會(huì)與電極直接接觸產(chǎn)生電化學(xué)現(xiàn)象而受到損壞。可以考慮在陣列電極上鋪設(shè)一層多孔水凝膠層，避免外泌體與電極直接接觸，發(fā)生電化學(xué)效應(yīng)。

2.3 利用流體動(dòng)力學(xué)特性分離外泌體

在黏彈性微流體中，作用在粒子上的黏彈性力可使其產(chǎn)生移動(dòng)［30］，并且黏彈性力的大小及其產(chǎn)生的位移與粒子的大小有關(guān)，因此微流體的黏彈性力可以作為一種簡(jiǎn)單的、無標(biāo)記的技術(shù)用于粒子的操縱和分離。黏彈性微流體的黏彈性力被廣泛用于腫瘤細(xì)胞、血細(xì)胞、細(xì)菌、液滴和微球體等微納物體的操縱和分離［30-33］。相對(duì)于聲流體、介電泳及磁性等其他技術(shù)方法，利用微流體黏彈性的分離方法可以在不施加額外的場(chǎng)力的條件下對(duì)微粒進(jìn)行精確操縱。盡管微流體黏彈性分離法有諸多優(yōu)點(diǎn)，但其并不能在納米粒子上產(chǎn)生足夠大的黏彈性力。針對(duì)一般黏彈性微流體不能直接分離外泌體的局限，Liu等［34］提出了利用聚氧化乙烯聚合物（Polyoxyethylene，PEO）作為介質(zhì)添加劑來改變流體的黏彈性。聚合物PEO可以增加微流體黏彈性的大小，從而增加作用在外泌體上的黏彈性力。如圖2-A-B所示，在分離過程中，控制入口和鞘流的流速使樣本最開始在微通道的兩側(cè)，尺寸較大的細(xì)胞外囊泡受到較大的黏彈性力移向通道中央，較小的外泌體受到的黏彈性力有限，位移較小，從而使外泌體和較大的細(xì)胞外囊泡移向不同的出口。

利用流體動(dòng)力學(xué)的特性，Wunsch等［35］設(shè)計(jì)了一種基于橫向位移的外泌體分離方法，如圖2-C。這種方法是通過光刻技術(shù)在微通道內(nèi)制造陣列納米柱來控制不同尺寸微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡，其中陣列納米微柱間隙為25-235 nm，最大角度為θmax= 5.7°。在該設(shè)計(jì)中，低于臨界尺寸的微粒隨著層流的流動(dòng)沿“Z”字型前進(jìn)，而大于臨界尺寸的微粒則以陣列納米柱設(shè)定的路徑前進(jìn)。通過優(yōu)化陣列納米柱的參數(shù)，就可以控制微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡，實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。

相對(duì)于其他微流控方法，利用微流體的流動(dòng)特性的分離方法不需要施加額外的場(chǎng)力，分離方便，且對(duì)外泌體的損害小，為微量樣本的外泌體分離和定量分析提供了新的思路。

2.4 其他微流控方法

不論是基于離心過濾的傳統(tǒng)方法，還是近年來新興的微流控分離方法均未在純度、回收率、生物活性等方面達(dá)到完全理想的分離效果。如今，研究人員越來越重視集成多種分離原理和方法，以期實(shí)現(xiàn)更好的分離效果。Davies等［36］結(jié)合微流體和過濾兩種方法，將納米多孔膜整合到微流控芯片上，形成微流控過濾系統(tǒng)。相對(duì)于常規(guī)的過濾方法，這種裝置可以通過改變致孔溶劑與預(yù)聚物溶液的比例控制納米孔的尺寸，使其適合于外泌體的提取和分離。并且此方法采用電泳驅(qū)動(dòng)過濾，消除了一些可溶性蛋白的干擾，從而提高了純度。另外，Yasui［37］設(shè)計(jì)了一種基于納米線的微流控芯片用于收集尿液中的外泌體。該芯片將帶正電的納米線固定在微流控通道的基底上，實(shí)現(xiàn)很高的收集效率。與超速離心法相比，該方法檢測(cè)樣本小、樣本處理時(shí)間短，且提取的miRNA的種類更多。該芯片為基于尿液樣本的疾病早期診斷提供了一種新的策略。

圖2 利用流體動(dòng)力學(xué)特性分離外泌體

基于免疫的方法一直是外泌體分離的一個(gè)重要分支，He等［38］開發(fā)了一種新的微流控方法，將磁珠集成在微流控芯片上，可以對(duì)外泌體進(jìn)行特異性免疫分離和靶向蛋白分析。該免疫磁珠結(jié)合微流控技術(shù)的方法不僅可以富集捕獲到外泌體，而且可以方便地制備透射電鏡表征樣品，從而提高捕獲效率以及分析的靈敏度。

除了上述的外泌體分離方法，也有一些針對(duì)特定應(yīng)用和特殊需求發(fā)展而來的分離方法。如Chiu等［39］為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的外泌體的實(shí)時(shí)檢測(cè)，提出了一種單細(xì)胞外泌體測(cè)定法。該方法設(shè)計(jì)并制造了一種帶網(wǎng)孔的PDMS基底，并在離心力作用下使每個(gè)網(wǎng)孔能夠裝載單個(gè)細(xì)胞并培養(yǎng)，然后利用固定有CD-63抗體的蓋玻片對(duì)應(yīng)收集每個(gè)網(wǎng)孔內(nèi)細(xì)胞分泌的外泌體。該方法可以在體外環(huán)境下定量分析單細(xì)胞分泌外泌體的數(shù)量，并研究藥物和酸性環(huán)境對(duì)外泌體分泌量和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

3 總結(jié)

盡管近年來外泌體的分離研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和不足。表1對(duì)幾種典型的外泌體分離方法在回收率、純度以及優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行了總結(jié)和對(duì)比。

基于離心和過濾的方法仍是最常用和有效的方法，一次性可以獲得大量的外泌體，但不適用于微量以及珍貴樣本。通過離心方法提取的外泌體純度、回收率以及生物活性都會(huì)受到離心力、離心時(shí)間等一些因素的影響，而且分離前需要復(fù)雜的準(zhǔn)備工作，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)（2-6 h）［40-42］。多步過濾的方法在前期準(zhǔn)備上仍然需要離心處理，步驟繁瑣，而且需要大量的樣本（30-100 mL），產(chǎn)率反而很低。免疫磁珠分離法的分離效果嚴(yán)重依賴于特異性抗體，成本高，且只能分離獲得與抗體親和的外泌體，造成某些種類的外泌體丟失。

近年來，微流控技術(shù)在外泌體分離中得到廣泛的應(yīng)用?；谖⒘骺丶夹g(shù)的分離方法具有分離速率較快，分離產(chǎn)率和純度較高，對(duì)樣本需求量較少的優(yōu)點(diǎn)，與上述傳統(tǒng)方法相比更適用于微量樣品分析，有望被廣泛應(yīng)用于未來個(gè)人醫(yī)療和精準(zhǔn)治療中。然而，當(dāng)前基于微流控的外泌體分離方法仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，還需要進(jìn)一步發(fā)展研究。

隨著外泌體分離方法和技術(shù)的發(fā)展，外泌體在細(xì)胞通信、疾病發(fā)生等重要生命活動(dòng)中的作用及機(jī)制會(huì)進(jìn)一步得到揭示，促進(jìn)疾病檢測(cè)及相關(guān)治療方法的發(fā)展。

表1 外泌體分離方法的比較