鄰苯二甲酸酯類污染物雌激素結(jié)合活性篩查

張曉聰 張冬生 劉蘭華 周小紅 劉春 陸韻 施漢昌

（1. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院 環(huán)境模擬與污染控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2. 河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018；3. 河北省食品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050200）

鄰苯二甲酸酯具有內(nèi)分泌干擾特性，高濃度暴露可誘導(dǎo)胎兒死亡、癌癥、畸形、肝臟和腎臟損傷及動(dòng)物的生殖毒性［1］。鄰苯二甲酸酯是一組合成的工業(yè)化學(xué)品，于20世紀(jì)20年代引入。自1933年首次合成鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di-（2-ethylhexyl）Phthalate，DEHP）以來，鄰苯二甲酸酯已成為最普遍的增塑劑［2］。各種鄰苯二甲酸酯的用途主要取決于它們的分子量，高分子量DEHP主要用作制造柔性乙烯塑料的增塑劑，而塑料則用于消費(fèi)品，地板和墻面覆蓋物，食品接觸應(yīng)用和醫(yī)療設(shè)備［3-4］。低分子量鄰苯二甲酸酯如鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）和鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）可用作溶劑、化妝品、殺蟲劑和藥物等［5］。這些常用的鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）可通過食品及飲料容器浸入食品并通過直接接觸或空氣接觸等被人體攝取。美國(guó)環(huán)保署已經(jīng)發(fā)布了129份重點(diǎn)污染物名單，其中包含6種鄰苯二甲酸酯：鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）、DEHP、DEP、鄰苯二甲酸二辛酯（Dioctyl phthalate，DOP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（Butyl benzyl phthalate，BBP）、DBP。中國(guó)環(huán)境優(yōu)先污染物清單也包括3種鄰苯二甲酸酯：DMP、DBP、DOP。盡管大量研究表明少量鄰苯二甲酸酯顯示出極弱的雌激素活性［6-7］，但人體長(zhǎng)期暴露在高濃度的具有雌激素活性的鄰苯二甲酸酯類環(huán)境中，可能對(duì)其產(chǎn)生生殖毒性。另外，關(guān)于可靠鑒定鄰苯二甲酸酯雌激素活性的標(biāo)準(zhǔn)和方法仍存在爭(zhēng)議。因此，發(fā)展相關(guān)檢測(cè)技術(shù)和方法具有重要的現(xiàn)實(shí)需求。

PAEs的檢測(cè)方法主要有儀器分析法和生物檢測(cè)法。儀器檢測(cè)方法包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［8］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［9］和高效液相色譜與熒光檢測(cè)器聯(lián)用［10］等。這些大型儀器分析技術(shù)雖然具有精度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，但也存在價(jià)格昂貴、樣品前處理過程復(fù)雜和檢測(cè)周期較長(zhǎng)等不足之處，而生物檢測(cè)法有受體作用理論法［11］、酵母雙雜交技術(shù)［12］和發(fā)光細(xì)菌法［13］等，具有靈敏度高、成本低、實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)短及倫理道德上可接受等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以課題組發(fā)展的倏逝波光纖生物傳感器平臺(tái)，以PAEs污染物為靶標(biāo)，優(yōu)化基于受體作用理論的雌激素結(jié)合活性篩查生物傳感分析方法，考察典型的PAEs的雌激素結(jié)合活性。

本課題研發(fā)的倏逝波光纖熒光生物傳感器系統(tǒng)主要包括3部分：光學(xué)元件、流動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、控制及信號(hào)處理系統(tǒng)（圖1-A），具體詳見Lin等［14］的研究，在此不再贅述。

圖1 倏逝波光纖熒光傳感器系統(tǒng)（A）和基于受體作用理論的雌激素篩查原理（B）

基于受體作用理論雌激素結(jié)合活性篩查原理如圖1-B所示。首先，將17β-雌二醇（E2）固定在光纖傳感界面上，再將外源雌激素化合物與一定量E2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體親和柱（受體蛋白通過6×His標(biāo)簽與親和柱（Ni-NTA-Sefinose Column）上的Ni通過配位結(jié)合得到受體親和柱）上的雌激素受體（Estrogen receptor，ER），剩余未結(jié)合的游離態(tài)E2通過離心分離后，與熒光標(biāo)記E2抗體結(jié)合。剩余游離熒光標(biāo)記E2抗體與傳感界面上固定的E2-BSA結(jié)合，在倏逝場(chǎng)激發(fā)下產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與外源化合物的雌激素結(jié)合活性呈負(fù)相關(guān)，由此可以定性考察化合物的雌激素結(jié)合活性大小。

1 材料與方法

1.1 材料

能夠表達(dá)人雌激素受體蛋白α配體結(jié)合域（ERLBD）的重組大腸桿菌由清華大學(xué)陸韻課題組提供；酵母提取物（Sigma，美國(guó)）；蛋白胨（Sigma，美國(guó)）；瓊脂粉（Sigma，美國(guó)）；氯化鈉（Sigma，美國(guó)）；異丙基硫代半乳糖苷（Sigma，美國(guó)）；卡那霉素（Sigma，美國(guó)）；蛋白質(zhì)Marker（TaKaRa，大連）；磷酸（H3PO4，國(guó)藥集團(tuán)，北京）；甲醇（國(guó)藥集團(tuán)，北京）；1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8（Solarbio，北京），1 mol/L Tris-HCl pH 6.8（Solarbio，北京），冰醋酸（CH3COOH，國(guó)藥集團(tuán)，北京）；咪唑（國(guó)藥集團(tuán)，北京）；17β-雌二醇（E2，Sigma），鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二異戊酯（Di-iso-amyl phthalate，DIPP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二辛酯（DOP），二甲亞砜（DMSO，Sigma），3-巰基丙基三甲氧基硅烷（MTS，Sigma），牛血清白蛋白（BSA，Sigma），十二烷基硫酸鈉（SDS，國(guó)藥集團(tuán)），N-琥珀酰亞胺基-4-馬來酰亞胺-丁酸酯（GMBS，Sigma），E2-BSA和抗E2單克隆抗體購(gòu)于北京勤邦生物技術(shù)有限公司，10 mmol/L PBS（pH 7.4）和超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 重組雌激素受體蛋白親和柱的制備 首先將凍存的菌體充分分散，再用低溫高壓細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破壁，將破壁后的菌液于4℃，14 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心45 min，收集上清蛋白提取液備用；以菌液與親合柱的比例為500：1來量取出所需親和柱的體積，清洗親和柱，隨后將蛋白提取液加入至預(yù)處理后的親和柱中，于4℃冰箱中混合孵育2 h；反應(yīng)后的受體蛋白親和柱于4℃，3 000 r/min轉(zhuǎn)速下水平離心2 min，棄去上清液，用Tris-HCl緩沖液和咪唑溶液等配制的平衡液清洗3次，最終得到純度較高的雌激素受體蛋白親和柱。

1.2.2 光纖敏感層修飾 將傳感光纖浸入新配置的Piranha溶液中，置于烘箱中70℃加熱60 min，使傳感光纖表面富含羥基基團(tuán)，之后用去離子水充分清洗，氮?dú)獯蹈?；將潔凈的羥基化光纖浸泡于硅烷化劑溶液，置于通風(fēng)櫥中室溫靜置反應(yīng)2 h，用甲苯清洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈?；把光纖置于1 mL的玻璃管中，加入偶聯(lián)劑溶液，靜置反應(yīng)1 h；配制合適濃度的包被抗原，將光線浸入包被抗原中，4℃下反應(yīng)過夜。過夜反應(yīng)后，用去離子水清洗數(shù)次，將表面固定包被抗原的光纖浸泡于封閉液中，室溫靜置反應(yīng)1 h，封閉未反應(yīng)的偶聯(lián)劑；最后，將光纖末端漆黑，靜置晾干后置于4℃冰箱保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法 對(duì)受體競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式來說，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系中標(biāo)準(zhǔn)曲線呈反S型，本研究采用4參數(shù)Logistic模型進(jìn)行模擬，其公式為：

其中，x為待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，為自變量；y為有效信號(hào)值；A1為曲線上漸近線（x→0）對(duì)應(yīng)的信號(hào)值；A2為曲線下漸近線（x→∞）對(duì)應(yīng)的信號(hào)值；x0為曲線的拐點(diǎn)；P為曲線在拐點(diǎn)處的斜率。該模型定義最大信號(hào)值（A1）的80%-20%對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度區(qū)間為定量檢測(cè)區(qū)間，最大信號(hào)值的90%對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度為檢出限。

2 結(jié)果

2.1 雌激素受體活性測(cè)試

為了驗(yàn)證所制備的雌激素受體親和柱的活性，對(duì)加熱變性前后傳感器得到的檢測(cè)信號(hào)值進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 ER活性測(cè)試

以1 μg/mL熒光標(biāo)記的E2抗體在傳感界面產(chǎn)生的信號(hào)為原始信號(hào)（柱1，100%），1 μg/mL熒光標(biāo)記的E2抗體與1 μg/L E2標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行反應(yīng)之后，剩余未結(jié)合E2的抗體結(jié)合在傳感界面上所產(chǎn)生的信號(hào)下降到原始信號(hào)的43%（柱2）。將1 μg/L E2標(biāo)準(zhǔn)液先與17.5 μg ER進(jìn)行結(jié)合之后，上清液中未與ER結(jié)合的E2再與1 μg/mL熒光標(biāo)記的E2抗體進(jìn)行反應(yīng)，未結(jié)合E2的抗體在傳感界面表面上所產(chǎn)生的信號(hào)為原始信號(hào)的98%（柱3）。將1 μg/L E2標(biāo)準(zhǔn)液先與17.5 μg 95℃熱變性之后的ER進(jìn)行結(jié)合之后，上清液中未與ER結(jié)合的E2再與1 μg/mL熒光標(biāo)記的E2抗體進(jìn)行反應(yīng)，未結(jié)合E2的抗體結(jié)合在傳感界面表面上所產(chǎn)生的信號(hào)為原始信號(hào)的49%（柱4）。

2.2 雌激素受體蛋白親和柱保存穩(wěn)定性測(cè)試

按照1.2方法制備得到的雌激素受體蛋白親和柱于 -80℃中分別保存 1、2、4、7、10、14、30、60、和90 d后取出，考察保存不同保存天數(shù)后受體蛋白的活性，測(cè)試結(jié)果如圖3所示。

圖3 ER親和柱長(zhǎng)期保存活性測(cè)試

2.3 甲醇試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

用濃度為0.01%、0.1%、1%、10%和50%甲醇溶液配制1 μg/mL E2溶液與ER反應(yīng)后，取上清液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。甲醇濃度在0.01%-10%范圍時(shí)，相對(duì)信號(hào)值接近100%；當(dāng)甲醇濃度為50%時(shí)，相對(duì)信號(hào)值下降到58%。

圖4 甲醇對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.4 鄰苯二甲酸酯雌激素活性測(cè)試

在優(yōu)化條件下，檢測(cè)7種鄰苯二甲酸酯DMP、DEHP、DEP、DOP、BBP、DBP和DIPP的雌激素結(jié)合活性，結(jié)果如圖5所示。PAEs濃度在1-103范圍之間時(shí)，其檢測(cè)信號(hào)基本保持一致；當(dāng)濃度為104時(shí)，BBP的相對(duì)熒光信號(hào)值為0.85，其他PAEs相對(duì)熒光信號(hào)較高；當(dāng)濃度為105時(shí)，BBP、DBP和DIPP的相對(duì)熒光信號(hào)值分別為0.71、0.76和0.83，其他PAE信號(hào)值接近1。

圖5 鄰苯二甲酸酯類雌激素活性測(cè)

3 討論

3.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

ER活性測(cè)試結(jié)果顯示，柱1表示原始信號(hào)值100%，柱2是E2與E2抗體反應(yīng)后所測(cè)的信號(hào)只有43%，說明它們之間可以發(fā)生免疫反應(yīng)；柱3的信號(hào)值為98%，說明ER可以完全與1 μg/L 的E2結(jié)合，而使上清液中沒有游離E2存在，因此熒光信號(hào)幾乎恢復(fù)到原始信號(hào)值大??；柱4為原始信號(hào)值的49%，說明ER完全失活，不能與E2進(jìn)行結(jié)合，同時(shí)也證明Ni親和柱不會(huì)對(duì)E2產(chǎn)生非特異性吸附，因此上清液中E2的濃度與反應(yīng)前幾乎沒有變化，熒光信號(hào)值與不加ER的信號(hào)值相當(dāng)。表明ER親和柱具有很好的E2結(jié)合活性。在雌激素受體蛋白親和柱保存穩(wěn)定性測(cè)試中，結(jié)果所示，保存3個(gè)月之后的檢測(cè)信號(hào)與初始信號(hào)相比幾乎沒有變化，說明本研究所采用的受體蛋白保存方法能長(zhǎng)期保持ER親和柱活性。甲醇濃度對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾表明，當(dāng)甲醇濃度低于10%時(shí)，溶液用的甲醇不會(huì)影響到整個(gè)反應(yīng)體系，當(dāng)甲醇濃度高于10%時(shí)，信號(hào)開始下降。甲醇含量為50%，傳感器測(cè)得的信號(hào)降至原始信號(hào)的58%，可能原因是高濃度的甲醇導(dǎo)致受體蛋白變性，不能結(jié)合E2，而使反應(yīng)后上清液中游離態(tài)的E2含量增加，導(dǎo)致傳感信號(hào)下降。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)體系中，保證甲醇的含量不高于10%。

3.2 鄰苯二甲酸酯的雌激素活性

本研究所選的PAEs化合物常作為增塑劑，而大部分增塑劑是有機(jī)酸的二酯或三酯，它們可以從塑料中緩慢釋放；并且已被證明暴露于體內(nèi)體外能夠誘導(dǎo)雌激素效應(yīng)［6］。在優(yōu)化條件下，對(duì)這7種PAEs進(jìn)行雌激素活性測(cè)試，向體系中加入等體積的PAEs和ER，其對(duì)應(yīng)的雌激素活性響應(yīng)信號(hào)曲線表明，在相同濃度下，雌激素結(jié)合活性越強(qiáng)，熒光信號(hào)越弱。根據(jù)這一規(guī)律分析，BBP、DBP和DIPP有一定的雌激素活性，其活性順序?yàn)锽BP ＞ DBP ＞DIPP，這一結(jié)果與已有的研究結(jié)果一致［7］，而另外4種物質(zhì)的雌激素結(jié)合活性很低，基本可以忽略。

4 結(jié)論

本研究所制備的ER親和柱具有很好的E2結(jié)合活性，所采用的受體蛋白保存方法能長(zhǎng)期保持ER親和柱活性。檢測(cè)中優(yōu)化的甲醇濃度為10%。在選取的7種物質(zhì)中，DMP、DEHP、DEP和DOP的雌激素活性很低，基本可以忽略，而BBP、DBP和DIPP有一定的雌激素活性，其活性順序?yàn)锽BP ＞DBP ＞ DIPP，與酵母雙雜交方法所測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以往研究結(jié)論一致，證明本研究使用的基于受體作用理論的倏逝波生物傳感分析技術(shù)能夠作為一種篩查PAEs雌激素活性的有效方法。