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    氣道上皮細胞對巨噬細胞表型和吞噬功能的影響及HIF-1α的作用*

    2019-01-21 12:33:34陳興無秦立龍孫珍貴臧蕾蕾王寒黎
    中國病理生理雜志 2019年1期
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)低氧表型

    陳興無, 邢 敏, 秦立龍, 孫珍貴, 臧蕾蕾, 王寒黎

    (皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 安徽 蕪湖 241001)

    慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的重要特征在于進行性氣道炎癥導(dǎo)致氣流受限和肺功能持續(xù)減退,其臨床過程中的關(guān)鍵事件是COPD急性加重(acute exacerbation of COPD,AECOPD),后者更進一步加速肺功能下降、損害健康狀況并增加死亡風(fēng)險,多由感染尤其是細菌感染觸發(fā)。巨噬細胞的重要功能之一是吞噬病原體,研究證明COPD患者氣道巨噬細胞吞噬能力減弱是細菌長期定植和AECOPD次數(shù)增多的核心[1]。巨噬細胞作用發(fā)揮與其表型密切相關(guān),已確定2種類型巨噬細胞:干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導(dǎo)的促炎或經(jīng)典活化巨噬細胞(M1巨噬細胞),白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)和IL-13誘導(dǎo)的抗炎或替代性活化巨噬細胞(M2巨噬細胞)。其中M1巨噬細胞表達高水平促炎細胞因子,在宿主防御細菌和病毒中發(fā)揮核心作用;M2巨噬細胞有助于炎癥的消退和損傷修復(fù)。因此,這2種表型巨噬細胞的相對比例對COPD疾病發(fā)展具有重要影響。COPD氣道中的復(fù)雜環(huán)境可以改變高度可塑的巨噬細胞表型。

    氣道感染與嚴重的局部低氧相關(guān),后者是COPD氣道炎癥微環(huán)境的一種常見現(xiàn)象。COPD患者通氣驅(qū)動減弱,氣道阻塞,肺泡壁增厚,肺泡毛細血管被破壞,從而在肺內(nèi)形成缺氧區(qū)域。此外,急性加重過程中氣道的感染和炎癥使得氧氣被炎癥細胞消耗,造成氧濃度低于1%(<8 mmHg)的低氧微環(huán)境。已知腫瘤組織低氧環(huán)境是腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)表型轉(zhuǎn)換的最主要原因[2]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是低氧和炎癥過程中激活的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,對免疫和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用,影響巨噬細胞炎性因子基因表達、表型和功能狀態(tài)。已報道COPD患者肺組織中支氣管上皮和上皮下纖維化組織HIF-1α表達上調(diào)或下調(diào)[3]。在部分人群HIF-1α遺傳多態(tài)性與COPD呈正相關(guān)。由于缺氧是COPD氣道微環(huán)境的持續(xù)性特征,探討低氧環(huán)境巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換和吞噬活性的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。

    氣道上皮細胞是氣道和外界環(huán)境接觸的第一道屏障,其通過調(diào)節(jié)固有免疫在預(yù)防和控制氣道感染發(fā)揮重要作用。正常情況下,上皮細胞與巨噬細胞密切聯(lián)系,氣道上皮細胞-巨噬細胞通迅紊亂被認為是早期炎癥信號的一個關(guān)鍵事件[4]。

    我們假設(shè)低氧狀態(tài)下氣道上皮細胞-巨噬細胞異常的串?dāng)_可能是巨噬細胞表型和吞噬功能變化的重要誘因。本研究以氯化鈷(cobalt chloride,CoCl2)刺激氣道上皮細胞模擬低氧環(huán)境,選擇趨化因子配體3(chemokine ligand 3,CCL3)作為M1巨噬細胞標(biāo)志物,CD163、CD206和CCL18作為M2巨噬細胞標(biāo)志物,利用細胞生物學(xué)技術(shù),探討氣道上皮細胞對巨噬細胞表型和吞噬活性的影響及HIF-1α的作用。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells,HBE cells; 江蘇齊式生物科技有限公司);人單核細胞系THP-1(杭州赫貝生物技術(shù)有限公司)。CoCl2、12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer I(Sigma);抗CD68抗體(Santa Cruz);Alexa Fluor? 488 donkey anti-rabbit IgG(Life);anti-human CCL3 PE、anti-human CD163 APC、anti-human CD206 APC、mouse IgG1κ isotype control PE、mouse IgG1κ isotype control APC(eBioscience);mouse anti-human CCL18 PE(BD);溴化乙啶(ethidium bromide,EB;上海生工生物有限公司);RNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa);定量PCR試劑盒SuperReal PreMix Color(北京天根生化科技公司)。Accuri流式細胞儀(BD)。

    2 方法

    2.1THP-1細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 THP-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%類胎牛血清(similar fetal bovine serum,SFBS)的DMEM培養(yǎng)液,以每孔5.0×105鋪至24孔細胞培養(yǎng)板中,加入終濃度為100 μg/L的PMA進行誘導(dǎo)分化。24 h后,進行免疫熒光染色,顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化的巨噬細胞。

    2.2HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染 HBE細胞以每孔5.0×105的密度接種培養(yǎng)于不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液(含10% SFBS)的24孔板,70%~80%融合后,換無血清培養(yǎng)液用于轉(zhuǎn)染。實驗分5組:對照(control)組(不轉(zhuǎn)染)、陰性對照siRNA(negative control siRNA, NC siRNA)組、HIF-1α-Homo-488 siRNA組、HIF-1α-Homo-1216 siRNA組和HIF-1α-Homo-1553 siRNA組。siRNA均由GenePharma合成,序列見表1。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 3000說明書,將5 μL siRNA 和5 μL Lipofectamine 3000分別溶于500 μL不含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)液中,室溫靜置5 min,混勻,靜置20 min后加入24孔板中。24 h后,利用RT-qPCR評估沉默效率。沉默效率最高的用于后續(xù)實驗。

    表1 siRNA序列

    2.3HBE細胞與巨噬細胞共培養(yǎng) HBE細胞以5.0×105鋪至24孔Transwell小室上室,培養(yǎng)于含10% SFBS的DMEM。24 h后換無血清培養(yǎng)基并以CoCl2處理,共分5組:HBE+CoCl2(0 μmol/L)組、HBE+CoCl2(100 μmol/L)組、HBE+CoCl2(200 μmol/L)組、HBE+CoCl2(400 μmol/L)組和HBE+CoCl2(800 μmol/L)組。各組細胞經(jīng)CoCl2處理24 h,與上述誘導(dǎo)分化的巨噬細胞共培養(yǎng)8 h、12 h或24 h,收獲上室HBE細胞用于隨后的HIF-1α mRNA檢測,收集下室巨噬細胞用于流式細胞術(shù)分析。

    在證實CoCl2(800 μmol/L)和HIF-1α-Homo-488 siRNA實驗效果最佳的基礎(chǔ)上,為探討HIF-1α的作用,將HBE細胞以每室5.0×105鋪至24孔Transwell小室上室,分3組:HBE+NC siRNA組(NC組)、HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA組(siRNA組)和HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L)組(siRNA-800組)。HBE細胞轉(zhuǎn)染同2.2,CoCl2同時加入,然后與誘導(dǎo)分化的巨噬細胞共培養(yǎng)24 h。

    2.4乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性的測定 按LDH測試試劑盒說明書(博士德)用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)測量490 nm 的吸光度(A)值。測定重復(fù)3次。

    2.5免疫熒光染色 誘導(dǎo)分化的巨噬細胞以4%多聚甲醛4 ℃固定15 min,PBS漂洗,0.1% Triton X-100溶液穿透,1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)+0.3 mol/L甘氨酸封閉。滴加CD68抗體200 μL,4 ℃過夜,室溫30 min,PBS漂洗,滴加Alexa Fluor? 488 donkey anti-rabbit IgG 200 μL,37 ℃避光孵育1 h,PBS漂洗。1% 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)室溫染核,PBS漂洗、甘油封片,熒光顯微鏡下(×200)觀察、拍照。

    2.6RNA分離和RT-qPCR 按試劑盒說明用RNA快速提取試劑盒提取總RNA,定量并評估RNA完整性。使用PrimeScriptTMRT試劑盒合成cDNA,進行反轉(zhuǎn)錄。定量PCR試劑盒SuperReal PreMix Color進行qPCR。β-actin表達作為內(nèi)參照,數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法進行分析。每個實驗重復(fù)3次。Homo-HIF-1α 的正向引物序列為5’-AGGCTACTTGTATCTTCTG-3’,反向引物序列為5’-CGTTGTGAGTGGTATTATTC-3’;內(nèi)參照Homo-ACTB的正向引物序列為5’-TAACGCAACTAAGTCATA-3’,反向引物序列為5’-TGAAGATCAAGATCATTG-3’。

    2.7流式細胞術(shù)分析巨噬細胞表面標(biāo)志物的表達 收集共培養(yǎng)的巨噬細胞,加入450 μL的PBS重懸,各取110 μL到4支EP管中,分別加入5 μL 抗CCL3、CD163、CD206和CCL18特異性抗體染色細胞,避光孵育30 min,同型對照細胞用PE或APC標(biāo)記的mouse IgG1κ isotype染色,用于非特異性背景染色。使用BD Accuri C6軟件通過BD公司的Accuri C6流式細胞儀分析CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達。

    2.8巨噬細胞吞噬大腸桿菌的檢測 按方法2.3將巨噬細胞與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)24 h;接種大腸桿菌于2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基平板上,37 ℃孵育24 h,挑取單個菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床過夜。離心去上清,加入1.25 mL 1% Triton X-100和5 mL FITC (20 mg/L),37 ℃避光孵育15 min,離心去上清,PBS重懸。將FITC標(biāo)記大腸桿菌加入共培養(yǎng)的巨噬細胞培養(yǎng)液中(大腸桿菌∶巨噬細胞=20∶1),37 ℃慢速搖動,每20 min取搖勻液0.5 mL,PBS漂洗,70%乙醇固定10 min,離心后加入1 mL EB(0.5 mg/L),37 ℃避光孵育15 min,運用流式細胞儀檢測巨噬細胞吞噬大腸桿菌能力。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準差(mean±SD)表示,多組間比較采用方差分析,與對照組比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 巨噬細胞的誘導(dǎo)分化

    以CD68抗體作為巨噬細胞標(biāo)志物,經(jīng)100 μg/L PMA誘導(dǎo)24 h后,THP-1巨噬細胞組CD68免疫熒光染色陽性,而陰性對照組CD68免疫熒光染色陰性,表明THP-1細胞被誘導(dǎo)分化為巨噬細胞,見圖1。

    Figure 1.The immunofluorescence analysis of CD68 expression in the THP-1 cells (×200). The scale bar=50 μm.

    圖1THP-1細胞CD68免疫熒光分析

    2 siRNA對HBE細胞HIF-1α表達的影響

    與NC siRNA組相比,HIF-1α-Homo-488 siRNA、HIF-1α-Homo-1216 siRNA和HIF-1α-Homo-1553 siRNA均顯著抑制HIF-1α的mRNA表達(P<0.05),其中HIF-1α-Homo-488 siRNA抑制效果最明顯,因此選擇HIF-1α-Homo-488 siRNA用于后續(xù)實驗,見圖2。

    Figure 2.The relative mRNA expression levels of HIF-1α in the HBE cells transfected with siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

    圖2轉(zhuǎn)染siRNA的HBE細胞HIF-1αmRNA相對表達水平的變化

    3 CoCl2對HBE細胞LDH釋放和HIF-1α表達的影響

    100~800 μmol/L的CoCl2處理24 h后,HBE細胞的LDH釋放量分別為0.61±0.05 (100 μmol/L組)、0.64±0.03 (200 μmol/L組)、0.67±0.04 (400 μmol/L組)和0.68±0.04 (800 μmol/L組),與對照組(0.61±0.03)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性。不同濃度CoCl2處理后,HBE細胞HIF-1α的mRNA表達水平均隨CoCl2濃度的增加呈上升趨勢,800 μmol/L為峰值;HIF-1α的mRNA水平上調(diào)在8 h為峰值,12和24 h漸減弱(P<0.05或P<0.01),見圖3。

    Figure 3.The relative mRNA expression levels of HIF-1α in the HBE cells treated with CoCl2at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

    圖3不同濃度CoCl2作用HBE細胞后HIF-1αmRNA相對表達水平的變化

    4 HBE細胞對巨噬細胞表型的影響

    流式細胞術(shù)分析巨噬細胞表面標(biāo)志物顯示,與CoCl2處理的HBE細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞CCL3、CD163、CD206和CCL18在8 h、12 h和24 h的熒光強度比率均隨CoCl2濃度增加呈上升趨勢,所有指標(biāo)數(shù)值均在800 μmol/L達峰值,與正常HBE共培養(yǎng)組比較顯著升高(P<0.05或0.01);共培養(yǎng)8 h或12 h的巨噬細胞CCL3較CD163、CD206和CCL18熒光強度比率上升幅度更明顯,而共培養(yǎng)24 h的巨噬細胞CD163、CD206和CCL18較CCL3熒光強度比率更明顯,見圖4~6及表2~4。與轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞,其CCL3、CD163、CD206和CCL18熒光強度比率均較與未轉(zhuǎn)染HBE細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞明顯降低(P<0.01),見圖7及表5。

    5 HBE細胞對巨噬細胞吞噬的影響

    與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)24 h的巨噬細胞對大腸桿菌的吞噬率在60 min前均呈不同的上升趨勢,其后吞噬率均較前降低。相對于正常HBE細胞共培養(yǎng)組,400和800 μmol CoCl2刺激組在各時點吞噬率均降低,其中800 μmol/L刺激組降低最明顯(P<0.01),見圖8,9。

    Figure 4.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 8 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2for 24 h.

    圖4流式細胞術(shù)檢測與經(jīng)CoCl2處理的HBE細胞共培養(yǎng)8h后巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達

    Figure 5.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 12 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2for 24 h.

    圖5流式細胞術(shù)檢測與經(jīng)CoCl2處理的HBE細胞共培養(yǎng)12h后巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達

    Figure 6.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 24 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2for 24 h.

    圖6流式細胞術(shù)檢測與經(jīng)CoCl2處理的HBE細胞共培養(yǎng)24h后巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達

    表2與經(jīng)CoCl2處理的HBE細胞共培養(yǎng)8h后巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強度比率

    Table 2.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2pretreatment for 24 h) for 8 h (%. Mean±SD.n=3)

    GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0 μmol/L)26.03±0.259.93±0.1511.03±0.257.87±0.42HBE+CoCl2(100 μmol/L)27.03±0.3110.07±0.1211.13±0.157.97±0.32HBE+CoCl2(200 μmol/L)28.63±0.64##10.13±0.1211.23±0.298.27±0.23HBE+CoCl2(400 μmol/L)32.10±0.40##10.37±0.06#11.63±0.15#8.83±0.25#HBE+CoCl2(800 μmol/L)33.03±0.45##10.73±0.15##12.33±0.25##9.30±0.36#

    #P<0.05,##P<0.01vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

    表3與經(jīng)CoCl2處理的HBE細胞共培養(yǎng)12h后巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強度比率

    Table 3.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2pretreatment for 24 h) for 12 h (%. Mean±SD.n=3)

    GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0 μmol/L)31.67±0.8721.97±0.5724.90±0.3016.00±0.30HBE+CoCl2(100 μmol/L)33.67±0.32#22.60±0.5024.97±0.2916.27±0.42HBE+CoCl2(200 μmol/L)34.93±0.91#23.37±0.29#25.27±0.2116.77±0.47HBE+CoCl2(400 μmol/L)36.67±0.45##23.73±0.38#25.77±0.40#17.57±0.46##HBE+CoCl2(800 μmol/L)40.00±0.26##24.43±0.32##26.53±0.49##21.03±0.12##

    #P<0.05,##P<0.01vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

    討 論

    本研究中,我們以CoCl2刺激HBE細胞模擬COPD發(fā)病過程中通常發(fā)生的低氧刺激,發(fā)現(xiàn)與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)的巨噬細胞吞噬率初期均呈不同的上升趨勢,相對于正常HBE細胞共培養(yǎng)組,400和800 μmol/L刺激組吞噬率降低,其中800 μmol/L刺激組降低最明顯。我們還發(fā)現(xiàn),CoCl2刺激的HBE細胞早期主要誘導(dǎo)M1巨噬細胞表型標(biāo)志物CCL3熒光強度比率上升;在較遲些階段主要誘導(dǎo)M2巨噬細胞表型標(biāo)志物CD163、CD206和CCL18熒光強度比率增高;而轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE細胞對巨噬細胞所有表型分子的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯減弱。

    表4與經(jīng)CoCl2處理的HBE細胞共培養(yǎng)24h后巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強度比率

    Table 4.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2pretreatment for 24 h) for 24 h (%. Mean±SD.n=3)

    GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0 μmol/L)37.83±0.3130.80±0.1733.30±0.6124.87±0.40HBE+CoCl2(100 μmol/L)38.17±0.3134.27±0.12##34.83±0.23#26.03±0.40#HBE+CoCl2(200 μmol/L)38.80±0.17##35.23±0.45##36.27±0.49##26.87±0.40##HBE+CoCl2(400 μmol/L)39.07±0.32##37.53±0.40##39.07±0.40##29.37±0.81##HBE+CoCl2(800 μmol/L)39.73±0.40##40.67±0.65##43.07±1.01##32.17±0.60##

    #P<0.05,##P<0.01vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

    Figure 7.The effect of HBE cells transfected with HIF-1α-Homo-488 siRNA on the expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages was detected by flow cytometry. The HBE cells and macrophages were co-cultured for 24 h. NC: HBE+negative control siRNA; siRNA: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA; siRNA-800: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L).

    圖7流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488siRNA的HBE細胞對巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18表達的影響

    已報道COPD患者肺泡巨噬細胞吞噬細菌能力減弱[1],導(dǎo)致氣道細菌定植增加,后者促進氣道慢性炎癥、急性加重和病情進展;然而,巨噬細胞吞噬功能減弱的確切機制仍然不清楚。巨噬細胞吞噬能力減弱可能與環(huán)境中炎癥介質(zhì)和表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。低氧是潛在的免疫調(diào)節(jié)劑,HIF-1α可作為免疫調(diào)節(jié)的主要因子,低氧微環(huán)境下HIF-1α的初始誘導(dǎo)激活信號級聯(lián),增強殺菌活性;另一方面,HIF-1α活化又不利于全身感染,導(dǎo)致更高的死亡率[5]。最近的實驗表明,HIF-1α也抑制氣道上皮細胞的先天性免疫應(yīng)答[6]。因此,HIF-1α的下調(diào)可以在以慢性炎癥為特征的疾病中具有治療效果。我們發(fā)現(xiàn)CoCl2濃度依賴性上調(diào)HBE細胞HIF-1α的mRNA表達水平;在8 h為峰值,其后漸減弱。將巨噬細胞與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)24 h,再研究共培養(yǎng)的巨噬細胞對大腸桿菌的吞噬情況,我們觀察到相對于正常HBE細胞共培養(yǎng)組,400和800 μmol/L刺激組吞噬率降低,其中800 μmol/L刺激組降低最明顯,表明隨上皮細胞損傷時間延長、程度加重,低氧環(huán)境的氣道上皮細胞可以減弱巨噬細胞的吞噬功能。

    表5與轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488siRNA的HBE細胞共培養(yǎng)24h后巨噬細胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強度比率

    Table 5.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (transfected with HIF-1α-Homo-488 siRNA) for 24 h (%. Mean±SD.n=3)

    GroupCCL3CD163CD206CCL18NC35.80±0.2631.17±0.3133.83±0.7224.33±0.72siRNA21.67±0.21##17.43±0.12##20.47±0.29##14.67±0.40##siRNA-80022.50±0.10##25.83±0.49##29.20±0.52##18.60±0.44##

    NC: HBE+negative control siRNA; siRNA: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA488; siRNA-800: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L).##P<0.01vsNC group.

    Figure 8.The images of flow cytometric analysis for determining macrophage phagocytosis ofE.coli.

    圖8巨噬細胞吞噬大腸桿菌流式細胞術(shù)直方圖

    目前認為,M1和M2巨噬細胞亞群比例失調(diào)調(diào)控氣道和肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展。有證據(jù)表明,M1和M2巨噬細胞同時存在于COPD氣道中[7]。本研究中,我們觀察到類似現(xiàn)象,上皮細胞-巨噬細胞相互作用誘導(dǎo)巨噬細胞表型動態(tài)轉(zhuǎn)換,在整個共培養(yǎng)過程中,上皮細胞對巨噬細胞M1和M2表型標(biāo)志物均有不同的誘導(dǎo)作用;但在早期,低氧激發(fā)的上皮細胞主要誘導(dǎo)巨噬細胞向M1表型轉(zhuǎn)換,表現(xiàn)為CCL3熒光強度比率較CD163、CD206和CCL18上升更顯著,表明急性組織損傷誘導(dǎo)促炎性M1表型引起急性炎癥反應(yīng)。之后,相同的刺激驅(qū)使M2表型優(yōu)勢轉(zhuǎn)換,這種現(xiàn)象與一些臨床現(xiàn)象較符合,曾有報道顯示吸煙者和COPD患者氣道管腔中M2巨噬細胞占優(yōu)勢,AECOPD患者支氣管BALF中M2表型和M2相關(guān)基因上調(diào),并且重度患者比輕中度患者CD163+、CD204+和CD206+肺泡巨噬細胞數(shù)量和比例明顯升高[8]。M2巨噬細胞吞噬作用不足,因此,長期低氧環(huán)境下,氣道上皮細胞誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型分化的比例高于M1型,巨噬細胞吞噬能力下降,可能是導(dǎo)致COPD肺部反復(fù)感染和頻繁加重的重要原因之一。

    Figure 9.The macrophage phagocytosis rate ofE.coli. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

    圖9巨噬細胞對大腸桿菌的吞噬率

    HIF-1α對巨噬細胞表型和功能狀態(tài)的影響仍不確定,在對肥胖機制研究中發(fā)現(xiàn),脂肪組織中低氧通過HIF-1α依賴性機制誘導(dǎo)巨噬細胞M1表型[9];另外的研究顯示,敲除HIF-1α的巨噬細胞M2標(biāo)志物更加突出伴隨細胞毒性降低。但對腫瘤細胞或模型研究則呈現(xiàn)不同現(xiàn)象,在乳腺腫瘤PyMT轉(zhuǎn)基因模型,腫瘤細胞糖酵解的副產(chǎn)物乳酸激活HIF-1α,調(diào)控TAMs精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1; M2標(biāo)志物之一)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS);特異性缺失HIF-1α的髓系細胞減弱TAMs表達Arg-1和iNOS。本實驗數(shù)據(jù)表明,支氣管上皮細胞的HIF-1α對M1、M2標(biāo)志物均有誘導(dǎo)作用,在不同時間、不同濃度狀況下,誘導(dǎo)的程度不一樣,較高濃度、早期可能主要誘導(dǎo)M1標(biāo)志物,而低濃度、長時間作用情況下,則主要誘導(dǎo)M2標(biāo)志物。當(dāng)然,HBE細胞誘導(dǎo)巨噬細胞表型標(biāo)志物改變也不排除其它介質(zhì)的參與。

    總之,我們的結(jié)果表明,低氧作用的氣道上皮誘使巨噬細胞吞噬作用減弱和向M1和/或M2重編程。這些觀察結(jié)果有助于從氣道上皮-巨噬細胞相互作用的關(guān)系角度闡明COPD頻繁發(fā)作型患者氣道巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化和功能減退的分子機制。調(diào)整氣道上皮-巨噬細胞的信息交流,改善巨噬細胞吞噬功能,調(diào)節(jié)M1/M2比例,均有助于減輕氣道炎癥并降低COPD加重的風(fēng)險。

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