SCNM1在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)及臨床意義*

吳玨堃， 熊志勇， 林良奕， 凌云彪

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1肝膽外科， 2甲狀腺乳腺外科， 廣東 廣州 510630； 3中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院普外科， 廣東 廣州 510530)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高且預(yù)后差，研究表明其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟和多基因參與的過程[1]。目前對于早期肝癌的根治性治療主要是手術(shù)切除、消融和肝移植，且預(yù)后較好，但就診的大部分患者已處于中晚期，失去根治性治療的機(jī)會(huì)[2]。因此，尋找可用于肝癌早期診斷的分子指標(biāo)、預(yù)測肝癌患者預(yù)后生存的標(biāo)志物對提高肝癌的早期診斷率和提高患者預(yù)后有重要的臨床意義。

離子通道(ion channels)是細(xì)胞膜上一類貫穿細(xì)胞膜的親水性蛋白質(zhì)微孔道，是維持機(jī)體生命活動(dòng)的重要組成。研究表明離子通道不僅維持正常機(jī)體運(yùn)轉(zhuǎn)，在腫瘤發(fā)生中也有著重要的作用，其中電壓門控鈉離子通道可改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，造成暫時(shí)性去極化狀態(tài)，進(jìn)而與腫瘤細(xì)胞的惡性程度和轉(zhuǎn)移性相關(guān)[3]。鈉離子通道調(diào)節(jié)蛋白1(sodium channel modifier 1，SCNM1)是離子通道中的一個(gè)類型，它在肝癌中的表達(dá)及具體機(jī)制作用尚不明了。本研究通過腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫研究SCNM1，驗(yàn)證SCNM1在肝癌中的高表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究擬結(jié)合我院臨床樣本，探討SCNM1在肝癌尤其是乙肝相關(guān)性肝癌中表達(dá)差異的臨床意義及對預(yù)后的影響，為進(jìn)一步研究SCNM1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供線索和思路。

材 料 和 方 法

1 數(shù)據(jù)資料的收集

標(biāo)本來源于2013年1月～2015年12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝膽外科接收治療的108例乙肝相關(guān)性肝癌患者。組織標(biāo)本取自肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣≥2 cm)，腫瘤切除后立即取出標(biāo)本并于-80 ℃凍存。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例術(shù)前未進(jìn)行過放射治療、化學(xué)治療及介入治療；(2)臨床資料完整；(3)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為肝細(xì)胞癌，同時(shí)根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)分級標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤分化度進(jìn)行分級。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其它腫瘤；(2)術(shù)后1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥、復(fù)發(fā)或死亡；(3)了解本研究同意參加該項(xiàng)目，但不能保證行規(guī)律隨訪的患者。所有患者均簽署由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的患者知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定，其中男92例，女16例；平均年齡(47.5±5.2)歲。

2 方法

2.1肝癌公共數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證 利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga)下載并預(yù)處理肝癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，TCGA數(shù)據(jù)集中包含乙肝相關(guān)性肝癌和非乙肝相關(guān)性肝癌的數(shù)據(jù)，在Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證SCNM1蛋白在肝癌中的表達(dá)水平，使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(包括Chen Liver、Mas Liver、Roessler Liver和Wurmbach Liver等共計(jì)875例肝癌組織)資料驗(yàn)證SCNM1在肝癌中的表達(dá)量。在TCGA數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證SCNM1對乙肝相關(guān)性肝癌患者預(yù)后的預(yù)測作用。

2.2RT-qPCR檢測乙肝相關(guān)性肝癌組織及癌旁組織中SCNM1的mRNA表達(dá) 按RNA提取試劑盒的步驟提取RNA，用分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度和純度分析。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)SCNM1和內(nèi)參照β-actin的引物序列(表1)。將1 μL cDNA+0.5 μL目的基因上游引物+0.5 μL 目的基因下游引物+8 μL SYBR+8 μL 雙蒸水建立20 μL的反應(yīng)體系，按“98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，42次循環(huán)；72 ℃ 10 min”的反應(yīng)條件放入PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)序列

2.3數(shù)據(jù)資料的處理 整理乙肝相關(guān)性肝癌樣本患者的臨床信息，進(jìn)行臨床病理資料分析。將乙肝相關(guān)性肝癌組織中SCNM1表達(dá)水平高于癌旁組織2倍的病例歸入高表達(dá)組，其余病例歸入低表達(dá)組。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SCNM1在肝癌中的表達(dá)

利用TCGA的數(shù)據(jù)我們分析了SCNM1在371例肝癌病例中mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SCNM1在肝癌中的mRNA相對表達(dá)水平明顯高于正常肝組織(t=4.077，P<0.01)，見圖1。

我們又對Oncomine數(shù)據(jù)庫中的臨床樣本進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCNM1在肝癌組織中的表達(dá)量均明顯高于正常肝組織(P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The mRNA expression level of SCNM1 in the hepatocellular carcinoma from TCGA database. Mean±SD.n=371.**P<0.01vstumor group.

圖1SCNM1基因在TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌中的表達(dá)水平比較

Figure 2.The mRNA expression of SCNM1 in hepatocellular carcinoma tissues from Oncomine database.n=875.

圖2SCNM1在Oncomine數(shù)據(jù)庫肝癌組織中的表達(dá)

為確定SCNM1蛋白表達(dá)的臨床意義，我們對Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中的臨床樣本進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCNM1在肝癌組織中的表達(dá)量均明顯高于正常肝組織，見圖3。

2 SCNM1在乙肝相關(guān)性肝癌細(xì)胞內(nèi)分布

為了解SCNM1蛋白在細(xì)胞中的分布情況，我們查找Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)庫收集了肝癌及肝正常組織的免疫組化圖片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCNM1主要分布于細(xì)胞核中，見圖4。

3 SCNM1在乙肝相關(guān)性肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，乙肝相關(guān)性肝癌組織中SCNM1的mRNA中位表達(dá)水平明顯高于其配對癌旁組織(t=8.082，P<0.01)，見圖5。

Figure 3.The expression of SCNM1 in hepatocellular carcinoma tissues from Human Protein Atlas database (×4).

圖3SCNM1在HumanProteinAtlas數(shù)據(jù)庫的肝癌組織中的表達(dá)

Figure 4.Distribution of SCNM1 protein in the hepatocellular carcinoma cells.

圖4SCNM1蛋白在肝癌細(xì)胞中的分布

Figure 5. The mRNA expression level of SCNM1 in hepatitis B-related hepatocellular carcinoma tissues. Mean±SD.n=108.**P<0.01vsadjacent.

圖5SCNM1在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)水平

4 SCNM1的表達(dá)水平與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系

將乙肝相關(guān)性肝癌組織中SCNM1表達(dá)水平高于癌旁組織2倍的病例歸入高表達(dá)組，其余病例歸入低表達(dá)組。關(guān)聯(lián)分析顯示，乙肝相關(guān)性肝癌患者中SCNM1表達(dá)水平與肝硬化、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和腫瘤大小具有相關(guān)性(P<0.05)，而與患者的性別、年齡和有無腫瘤包膜侵犯等臨床病理特征相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2。

表2SCNM1表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析

Table 2. Correlation analysis between the mRNA expression of SCNM1 and clinicopathological features of the patients with hepatitis B-related hepatocellular carcinoma

Clinicopathological featureSCNM1 mRNA expressionLow expression(n=40)High expression(n=68)2 P Age (year) ≤5521483.5720.059 >551920Sex Male36561.1670.280 Female412Cirrhosis Yes124918.125<0.001 No2819Splenomegaly Yes1092.4040.121 No3059ALB (g/L) >40 20290.5490.459 ≤402039TB (μmol/L) >17 32461.9160.166 ≤17822ALT (U/L) >40 19518.3520.004 ≤402117AFP (μg/L) >400 19422.0850.149 ≤4002126Tumor size (cm) >5 16414.1620.041 ≤52427Degree of differentiation Well differentiated 9160.0150.903 Moderately differentiated and poorly differentiated3152Microvascular invasion* Yes 13161.0320.310 No2752Tumor capsule Incomplete 27531.4300.232 Complete1315

*mainly depended on the pathology report from The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. ALB: albumin; TB: total bilirubin; ALT: alanine aminotransferase; AFP: alpha-fetoprotein.

5 SCNM1的mRNA表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌預(yù)后的相關(guān)性

為分析SCNM1的表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌預(yù)后的相關(guān)性，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了乙肝相關(guān)性肝癌SCNM1的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)腫瘤患者生存時(shí)間數(shù)據(jù)。利用Kaplan-Meier plotter對這些腫瘤的數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCNM1的表達(dá)與肝癌患者的總生存率有相關(guān)性(HR=1.53，P=0.016)，SCNM1的mRNA表達(dá)水平越高，肝癌患者總生存時(shí)間越短，見圖6A。我們進(jìn)一步分析了乙肝相關(guān)性肝癌的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCNM1的mRNA表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌總生存率相關(guān)(HR=2.41，P=0.015)，見圖6B。

Figure 6.The effect of SCNM1 expression on the survival rate of hepatocellular carcinoma patients (A) and hepatitis B-related hepatocellular carcinoma patients (B).

圖6SCNM1對肝癌及乙肝相關(guān)性肝癌病人生存率的影響

討 論

本文提供的數(shù)據(jù)分為數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)和我們自己收集的標(biāo)本。我們自己收集的標(biāo)本均為乙肝相關(guān)肝癌，數(shù)據(jù)庫中包括有乙肝和非乙肝的肝癌樣本，預(yù)后分析使用的是數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，所以總的肝癌樣本分析一次，把本研究組收集的乙肝相關(guān)肝癌樣本再分析一次。

研究表明，離子通道可通過調(diào)節(jié)信號通路的下游效應(yīng)物分子進(jìn)行表觀遺傳學(xué)和基因表達(dá)的調(diào)控修飾，腫瘤中離子通道異常表達(dá)或活性改變可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，其中鉀和鈣離子通道可參與調(diào)節(jié)腫瘤新生血管形成，鈉和氯離子通道調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力[4]。進(jìn)而有研究報(bào)道，離子通道通過膜蛋白負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞外事件與細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答的偶聯(lián)以及維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)在腫瘤發(fā)生的病理生理層面有著重要作用[5]。

根據(jù)鈉離子通道被激活方式的不同，主要分為電壓門控鈉離子通道、酸質(zhì)子門控鈉離子通道和濃度門控鈉離子通道3大類。最新研究表明，鈉離子通道在結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌及非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，并且與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[6]。SCNM1是一類鋅指蛋白和剪接因子，在小鼠中，SCNM1改變SCN8A(MIM 600702)突變的表型表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控鈉離子通道。

本研究利用TCGA的數(shù)據(jù)分析了SCNM1基因在肝癌中mRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)SCNM1在肝癌中的表達(dá)明顯高于正常肝組織，利用臨床肝癌標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)SCNM1在乙肝相關(guān)性肝癌中的表達(dá)同樣明顯高于癌旁組織。我們利用Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中的樣本對SCNM1的細(xì)胞內(nèi)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)SCNM1主要分布于細(xì)胞核中，關(guān)聯(lián)分析顯示，乙肝相關(guān)性肝癌患者中SCNM1表達(dá)水平與肝硬化、ALT和腫瘤大小具有相關(guān)性，而與患者的性別、年齡和腫瘤包膜等臨床病理特征無相關(guān)。生存分析表明，SCNM1的表達(dá)與肝癌及乙肝相關(guān)性肝癌患者的總生存率均具有相關(guān)性，SCNM1表達(dá)越高，肝癌及乙肝相關(guān)性肝癌患者總生存時(shí)間更短。

本文通過生物信息學(xué)分析及臨床數(shù)據(jù)為SCNM1基因的研究提供了基礎(chǔ)。綜上所述，SCNM1與乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切相關(guān)性，對其深入的研究可進(jìn)一步揭示其在乙肝相關(guān)性肝癌中的功能及作用機(jī)制，為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的思路。