少腹逐瘀湯對子宮內膜異位癥大鼠MAPK/ERK信號通路的影響*

王金霞， 崔宇紅， 成映霞， 范琳琳， 張小花， 范東英

(甘肅中醫(yī)藥大學， 甘肅 蘭州 730000)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EM)簡稱內異癥，是一種依賴于血管生成和對雌激素敏感的慢性炎癥性疾病，在孕齡期不孕婦女患者中發(fā)病率高達30%[1]。EM 由有生長功能的子宮內膜(腺體和間質)侵襲、轉移到宮腔及其它器官表面而形成[2]，盆腔炎癥、血管生成和疼痛[3-4]是其主要的臨床癥狀。EM臨床上以手術、藥物及其聯(lián)合治療為主，降低炎性因子和疼痛介質的水平，阻滯血管生成，有效緩解疼痛。臨床常用西藥有促性腺激素釋放激素激動劑、達那唑和孕三烯酮等，長期服用會抑制排卵，出現(xiàn)更年期綜合征等，副作用明顯，停藥后復發(fā)率較高[5]。痛經寶顆粒由當歸、肉桂和木香、莪術、五靈脂、丹參、紅花和延胡索等9味中藥組成，具有溫經化瘀和抗炎鎮(zhèn)痛的功效[6]。中藥少腹逐瘀湯(Shaofu-Zhuyu decoction, SFZY)方劑由當歸、川芎、赤芍、肉桂、小茴香等組成，與痛經寶顆粒具有相似功效且能更好地調理婦女全身癥狀，在EM治療中被廣泛使用，但其作用機制尚不完全清晰。故本研究運用少腹逐瘀湯對子宮異位癥大鼠進行干預，擬從絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) /細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路及其關鍵分子揭示EM的炎癥、血管生成機制，并為少腹逐瘀湯在EM臨床中應用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1實驗動物 SPF級SD雌性大鼠60只，體質量(200±30) g，購于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證號為62000600000299和62001000000356。

1.2實驗藥物與試劑 少腹逐瘀湯處方為當歸9 g、生蒲黃9 g、五靈脂6 g、赤芍6 g、小茴香3 g、醋延胡索3 g、沒藥3 g、川芎3 g、肉桂3 g和炮姜0.6 g。以上藥物均購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，按比例稱取少腹逐於湯組方藥材5.58 kg，粉碎至粒徑40目，分2次煎煮(第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮2 h)，合并煎煮液濃縮至5 kg左右，SD大鼠給藥量按照以下計算：人臨床用量×0.018/200×得率×1 000×臨床等效量的倍數(shù)。痛經寶顆粒(國藥準字Z41021972)由仲景苑西制藥股份有限公司生產。所用ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物；所用抗體均購自Abcam；RT-qPCR試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa。引物由寶生物工程(大連)有限公司設計合成。

2 實驗方法

2.1動物模型的建立 參照文獻[7]，大鼠常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周，手術前2 d以戊酸雌二醇0.5 mg/kg灌胃，使大鼠處于統(tǒng)一動情期。造模時用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔麻醉，碘伏消毒腹部皮膚，鋪巾，內異癥造模方法參考文獻并加以改進，尿道口上方約1 cm處正中開腹，切口約2 cm，找到左側子宮，在離卵巢約1 cm處，結扎子宮兩頭，剪下中間的一段子宮(約2 cm)，立即置于生理鹽水中，分離附著于子宮漿膜面脂肪組織，縱形剖開子宮，并注意區(qū)分子宮內外面。在距腹部切口約1.5 cm處，將分離好的子宮組織內膜面緊貼在右側腹壁，用無菌4-0可吸收線對角固定兩頭，青霉素1.6×105U/kg留置腹腔，逐層縫合腹部切口，常規(guī)關腹。術后連續(xù)3 d肌注青霉素1.6×105U/kg預防感染。

2.2動物分組與給藥 將造模成功的大鼠隨機分為5組：模型(model)組、痛經寶陽性對照(positive control)組及少腹逐瘀湯低、中、高劑量(low dose of SFZY、middle dose of SFZY和high dose of SFZY)組，每組10只；造模同時另取10只大鼠只行開腹手術，不進行子宮剪切、內膜移植，其余操作同上，作為空白對照(blank control)組。藥物干預組給藥量按人體給藥量換算，少腹逐瘀湯低、中、高劑量組每只大鼠給予相當于生藥量2.5 g/kg、5 g/kg和10 g/kg的少腹逐瘀湯藥液灌胃；陽性藥物組給予0.04 g/kg痛經寶顆粒灌胃；空白對照組和模型組灌胃給予同體積的蒸餾水。每日1次，連續(xù)灌胃4周。

2.3HE染色 取大鼠異位子宮組織，置于無菌培養(yǎng)皿中用4%多聚甲醛固定24 h后，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟，蘇木素染色，鹽酸乙醇分色、伊紅染色、中性樹膠封片等步驟，光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.4ELISA實驗 取大鼠異位子宮組織，加入預冷PBS，在冰上研碎，13 000 r/min離心15 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書進行實驗。在抗體包被的96孔板中，分別加入標準品作標準曲線，在其它孔中再加入上清以作實驗組，37 ℃孵育30 min后，洗去，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗孵育30 min，洗去，而后依次加入顯色液、終止液，最后在酶標儀上以570 nm激發(fā)檢測吸光度(A)值。

2.5RT-qPCR實驗 取大鼠子宮組織約100 mg，液氮研磨后，加TRIzol、氯仿、異丙醇等提取總RNA。取1 μL提取的RNA經超微量分光光度計檢測A260/A280的比值在1.8～2.0，提示RNA質量較好?？俁NA用 gDNA Eraser處理后，采用逆轉錄試劑盒將純化的RNA逆轉錄合成cDNA。以cDNA作為模板進行qPCR擴增。實時熒光定量PCR采用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒，在Mx3000P實時熒光定量PCR儀(Agilent)上進行，分別擴增ERK、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)和內參照GAPDH(引物序列見表1)。每個反應設3個重復。反應條件為：預變性 95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40循環(huán)。擴增結束后確認擴增曲線和熔解曲線，確認得出數(shù)據(jù)的可信性。采用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequence for RT-qPCR

2.6Western blot實驗 取大鼠異位子宮組織，加入裂解液，置于冰上研碎至勻漿后，離心取上清，加上樣緩沖液，煮沸變性后，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，再經過轉膜、封閉、孵育抗體后加發(fā)光液，曝光顯影，最后進行拍照分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差(Mean±SD)。多組間比較用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用SNK-q法，方差不齊時用Dunnett’s方法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠子宮組織病理變化

與空白對照組相比，模型組大鼠異位子宮內膜增生明顯，有大量血管生成，并伴有大量炎癥細胞浸潤；與模型組相比，陽性對照組大鼠子宮內膜逐漸萎縮，血管數(shù)量和浸潤的炎癥細胞數(shù)量得到有效遏制，與空白對照組基本一致；與模型組相比，隨著少腹逐瘀湯劑量的增加，子宮內膜厚度逐漸變薄，血管數(shù)量和浸潤的炎癥細胞數(shù)量逐漸減少，其中高劑量組子宮內膜厚度、血管數(shù)量和浸潤的炎癥細胞數(shù)量與陽性對照組幾乎一致，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of the uterus of rats (HE staining, ×200).

圖1各組大鼠宮腔組織病理變化

2 各組大鼠子宮組織中TNF-α、IL-6及IL-8的變化

與空白對照組相比，模型組大鼠異位子宮組織中TNF-α、IL-6及IL-8含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組及少腹逐瘀湯中、高劑量組大鼠子宮組織中TNF-α、IL-6及IL-8含量顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 子宮組織中TNF-α、IL-6及IL-8含量Table 2.The levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 in the uterus of rats (ng/L.Mean±SD. n=10)

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmodel group.

3 各組大鼠子宮組織中ERK、VEGF和MMP-9的mRNA表達變化

與空白對照組相比，模型組大鼠異位宮腔組織中ERK、VEGF和MMP-9的mRNA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組大鼠宮腔組織ERK、VEGF 和MMP-9的mRNA含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，少腹逐瘀湯中、高劑量組大鼠宮腔組織ERK、VEGF和MMP-9的mRNA含量亦顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of ERK, VEGF and MMP-9 in the rat uterus. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsblank control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

圖2大鼠子宮組織中ERK、VEGF和MMP-9mRNA表達量的變化

4 各組大鼠子宮組織中NF-κB、MAPK和MEK蛋白的變化

與空白對照組相比，模型組的NF-κB、MAPK和MEK蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，藥物干預組的NF-κB、MAPK和MEK蛋白表達均有所下調，并且隨著劑量的增加，NF-κB、MAPK和MEK的蛋白表達量逐漸減少，其中陽性對照組及少腹逐瘀湯中、高劑量組顯著下降(P<0.05)，表明藥物可以劑量依賴性地抑制NF-κB、MAPK和MEK的蛋白表達，見圖3。

Figure 3.The protein expression of NF-κB, MAPK and MEK in the rat uterus. Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

圖3大鼠子宮組織中NF-κB、MAPK和MEK的蛋白表達

討 論

本研究將大鼠子宮內膜移植于腹壁建造自體內膜異位癥模型，模擬臨床上較常見的子宮內膜異位癥。少腹逐於湯作為臨床上使用廣泛的治療子宮內膜異位癥的中藥方劑，具有活血化瘀、養(yǎng)血調經、溫陽散寒和鎮(zhèn)痛抗炎等功效。臨床研究表明少腹逐瘀湯及其加減法治療子宮內膜異位癥及伴發(fā)痛經療效顯著[8-10]。本研究結果顯示，少腹逐於湯治療子宮內膜異位大鼠后，經HE染色、ELISA、Western blot和RT-qPCR技術檢測可知，大鼠內異癥癥狀得到有效改善。

子宮內膜異位癥是一種依賴血管生成和對雌激素敏感的炎癥性疾病。關于內異癥發(fā)病機制的學說主要有：經血逆流內膜種植、免疫缺陷和體腔上皮生化等，經血逆流學說居于主導地位。逆流的經血中有大量脫落的內膜間質細胞(可在腹膜、卵巢及其它組織表面種植)和一些其它子宮內膜的組織，可引起局部炎癥反應。長期的炎癥反應與血管生成、粘連等緊密相關，嚴重者可致患者疼痛、不孕[11-12]。研究表明，內異癥病灶的發(fā)生、發(fā)展直接依賴于血管的形成[13-14]。VEGF通過雌激素介導可提高血管壁通透性和促進血管生長[15]。子宮內膜異位癥患者體內VEGF高表達[16-17]，VEGF與受體結合后激活磷脂酶C和蛋白激酶C，啟動MEK-ERK通路促進血管形成。本研究結果顯示，模型組中VEGF mRNA表達量較空白對照組、陽性藥物組、少腹逐於湯中高劑量組顯著升高，說明少腹逐於湯可減少異位組織中VEGF表達量，抑制血管的生成。

本研究結果還發(fā)現(xiàn)，模型組中ERK mRNA和MEK蛋白的含量較空白對照組顯著增加，而少腹逐於湯可減少異位組織中ERK mRNA和MEK蛋白的含量。這與其它學者研究結果相同：子宮內膜異位癥病灶組織中雌激素[18]、ERK[19]的表達量顯著增加，降低磷酸化的ERK蛋白水平能顯著降低異位內膜細胞的增殖[20]。此外，ERK有利于炎性因子IL-6和IL-8等的表達[21]。在軟骨定向分化中高水平的IL-6可激活MAPK/ERK通路[22]，而激活的MAPK/ERK信號通路可促進IL-1、TNF-α和NF-κB生成[23]。本研究中模型組大鼠異位子宮組織中TNF-α、IL-6及IL-8因子的含量顯著升高，NF-κB蛋白的表達量顯著升高。高含量的炎性因子促使NF-κB蛋白的含量增加，從細胞質移至細胞核內，發(fā)揮轉錄因子活性而調控下游靶基因，可促進TNF-α、IL-6及IL-8的表達，進而使異位子宮炎癥加重。本實驗中子宮內膜異位癥大鼠給予少腹逐瘀湯治療后，可明顯減少異位組織中TNF-α、IL-6及IL-8含量，降低NF-κB蛋白和VEGF的mRNA的含量，表明少腹逐瘀湯可阻滯異位子宮組織中炎性因子的增多和血管生成，緩解異位病灶的發(fā)展。

MMP-9可促進內膜異位癥異位內膜細胞的遷移和生長[24]，且異位內膜細胞具有較強的產生MMP-9的能力，這使得異位內膜具有更強的水解能力，MMP-9可降解異位內膜周圍的基底膜，破壞腹膜間質細胞的連接，使異位內膜在腹腔內易種植、生長并使病灶不斷擴大[25]。MMP-9含量在內膜異位癥患者體內呈高表達[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組大鼠子宮組織中MMP-9 mRNA的含量顯著升高；與模型組相比，少腹逐瘀湯中、高劑量組的大鼠異位子宮中MMP-9的mRNA含量顯著降低。

子宮內膜異位癥的異位組織中MAPK、ERK、MEK、VEGF和MMP-9的含量較高，激活MAPK/ERK信號通路，該信號通路激活后會促使炎性因子、生長因子等高表達，進而加重子宮內膜異位癥的病情。本研究中少腹逐瘀湯可有效抑制NF-κB、MEK、MAPK蛋白與ERK、VEGF、MMP-9 mRNA等的表達，降低TNF-α、IL-6和IL-8的含量。推測，異位子宮組織經少腹逐瘀湯治療后在雌激素介導下通過MAPK/ERK信號通路下調TNF-α、IL-6、IL-8、NF-κB、MEK、MAPK、ERK、VEGF和MMP-9等的表達，抑制異位組織中炎癥因子和血管生成，減緩子宮內膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展。