甲基硫菌靈降解菌的篩選與鑒定

馬俊紅 周厚發(fā) 雷麗萍

摘要：為篩選出具有降解甲基硫菌靈能力的菌株，并對(duì)甲基硫菌靈的降解效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，采集云南各地植煙土壤樣品，在以甲基硫菌靈為單一碳源的選擇性培養(yǎng)基中富集微生物，用梯度稀釋法分離出451株農(nóng)藥降解菌株。通過(guò)搖瓶培養(yǎng)和高效液相色譜法從451株菌株中篩選得到降解效率在80%以上的20株菌株。繼續(xù)對(duì)菌株的甲基硫菌靈降解能力進(jìn)行溫室和田間篩選，結(jié)果表明，田間煙草施用甲基硫菌靈降解菌7 d后，參試的20株細(xì)菌均有降解甲基硫菌靈的效果，降低幅度為14.45%～91.84%。其中TP247、TP185、TP243、TP208、TP416等5株菌降解效果較好，分別為 91.84%、90.34%、89.54%、87.33%、85.50%，具有大面積應(yīng)用推廣潛力。

關(guān)鍵詞：甲基硫菌靈;降解菌;高效液相色譜法;降解率

中圖分類號(hào)： S481+.8;X592 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0298-05

甲基硫菌靈別稱甲基托布津，是一種具有內(nèi)吸性強(qiáng)、高效低毒、安全廣譜等優(yōu)點(diǎn)的強(qiáng)力殺菌劑，是在煙草上登記使用的農(nóng)藥之一，主要用于煙草白粉病、根黑腐病等的防治[1]。目前，化學(xué)防治是煙草病蟲(chóng)害防治的主要措施之一，廣泛大量和長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥造成了煙葉中農(nóng)藥殘留量的增加。煙草雖然不被直接食用，但其在燃燒過(guò)程中會(huì)發(fā)生大量復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，殘留農(nóng)藥會(huì)直接或間接參與其中[1-2]，因此，農(nóng)藥殘留問(wèn)題已經(jīng)引起煙草界和全社會(huì)的廣泛關(guān)注。

目前國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥殘留降解方法主要有超聲波技術(shù)、吸附、洗滌和電離輻射等物理方法，水解、氧化分解和光化學(xué)降解等化學(xué)方法，微生物、降解酶和工程菌等生物降解方法[3]。微生物降解被公認(rèn)為是一種有效、廉價(jià)、無(wú)二次污染的方法，具有操作簡(jiǎn)便、繁殖快、生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。早在20世界80年代密歇根州立大學(xué)的James Tiedje實(shí)驗(yàn)室，就首次從污染的河泥中分離出了具有脫氯功能的厭氧微生物[6-7]。迄今為止，各國(guó)科研人員已經(jīng)從土壤、污泥、污水、天然水體、垃圾場(chǎng)和廄肥中分離到降解多種農(nóng)藥的活性微生物[8]。甲基硫菌靈是在煙葉農(nóng)殘中檢出率較高的農(nóng)藥之一，控制該農(nóng)藥殘留量意義重大。本研究對(duì)甲基硫菌靈農(nóng)藥降解菌進(jìn)行分離、篩選、初步鑒定以及溫室和田間篩選，為煙葉和植煙土壤中甲基硫菌靈農(nóng)藥污染的治理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品 試驗(yàn)于2014年1月至2016年12月在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和試驗(yàn)基地進(jìn)行。本試驗(yàn)用土壤采集自云南省昆明市、曲靖市、玉溪市、昭通市、麗江市、普洱市、保山市、臨滄市、楚雄州、紅河州、迪慶州、文山州、西雙版納州、大理州、德宏州、怒江州等16州（市）植煙土壤，共500份。

1.1.2 培養(yǎng)基 M9培養(yǎng)基配制：分別稱取3 g Na2HPO4、1.5 g KH2PO4、0.5 g NH4Cl，加500 mL蒸餾水，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，配制固體平板時(shí)加入7～8 g/L瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌，待溫度冷卻至50～60 ℃時(shí)分別加入0.5 mL 1 mol/L 的CaCl2和MgSO4·7H2O，終濃度為0.1%的甲基硫菌靈;LB液體培養(yǎng)基：5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g NaCl，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值=7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂2%，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.1.3 供試煙草 供試煙草品種為云煙87，旺長(zhǎng)期的煙株用于溫室和田間甲基硫菌靈降解菌的篩選。

1.1.4 供試農(nóng)藥 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，1 000倍液噴霧。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甲基硫菌靈降解菌分離和純化 量取45 mL純凈水盛于三角瓶?jī)?nèi)，在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。稱取5 g土樣放入滅菌的三角瓶?jī)?nèi)，置于30 ℃、150 r/min搖床搖培 30 min，靜置10 min，取200 L上清液涂布于M9平板，置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，挑選單菌落劃線于LB平板，純化后獲得單菌落，液體搖培并用20%甘油重懸浮，置于-80 ℃條件下保藏。

1.2.2 甲基硫菌靈降解菌的篩選 稱取6 g甲基硫菌靈粉劑溶于1 000 mL丙酮，配制成0.6%甲基硫菌靈母液。取已滅菌好的LB液體培養(yǎng)基5 mL于試管內(nèi)，接種甲基硫菌靈降解菌于三角瓶中培養(yǎng)1 d后，加入1 mL甲基硫菌靈母液，置于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3 d后檢測(cè)菌液中甲基硫菌靈含量，評(píng)價(jià)各菌株的降解效果。

1.2.3 甲基硫菌靈含量測(cè)定 樣品處理：培養(yǎng)菌液 5 000 r/min 離心10 min去除沉淀，用0.45 m濾膜過(guò)濾上清液，取10 L樣品經(jīng)高效液相色譜儀分析;測(cè)定色譜分析條件：試驗(yàn)采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫為30.0 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，參比波長(zhǎng)為400 nm，流動(dòng)相的A相為CH3OH、B相為H2O、C相為CH3CN，流速 1 mL/min，每次進(jìn)樣量10.0 μL，洗脫程序見(jiàn)表1。

1.2.4 甲基硫菌靈降解菌株的鑒定 將降解甲基硫菌靈效果較好的37株菌，PCR擴(kuò)增16S rDNA片段。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行序列測(cè)定。將所得序列與EzBilCloud數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）中標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLASTn分析，比較序列同源性。

1.2.5 甲基硫菌靈降解菌溫室篩選 使用室內(nèi)篩選出的甲基硫菌靈降解菌，分別用100 mL LB培養(yǎng)基30 ℃搖培3 d，離心去除培養(yǎng)基，沉淀用無(wú)菌水懸浮，調(diào)整到菌體含量為 108 CFU/mL 備用。

農(nóng)藥噴施1 d后，噴施不同菌懸液，每株菌處理3株煙，設(shè)不施菌的處理為對(duì)照（3株）。分別于降解菌處理14 d后取煙葉樣品，每次每煙株取3張葉，相同處理的煙葉樣品計(jì)數(shù)1份樣品，取樣時(shí)所取煙葉部位相同。樣品采集后，將其置于烘箱內(nèi)105 ℃殺青30 min，60 ℃條件下烘干，去中脈，粉碎過(guò)20目篩，檢測(cè)甲基硫菌靈含量。

1.2.6 甲基硫菌靈降解菌田間篩選 使用溫室內(nèi)篩選的甲基硫菌靈降解菌進(jìn)行田間篩選，降解菌處理14 d后取煙葉樣品測(cè)試農(nóng)藥殘留量，田間管理、樣品采集和檢測(cè)方法同 “1.2.5” 節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲基硫菌靈降解菌分離

以甲基硫菌靈為唯一碳源的培養(yǎng)基，采用稀釋平板法分離500份土樣，分離到451株菌株。分離結(jié)果表明，土壤樣品中能降解甲基硫菌靈的可培養(yǎng)微生物較少，43.6%的土樣僅能分離到1株菌株，有36.4%的樣品不能分離到降解菌，能分離2株以上菌株的土樣僅占總土樣的20%。土壤樣品最多僅能分離到4株降解甲基硫菌靈的菌株，占總土樣的1.6%，僅有8份土樣。通過(guò)對(duì)500個(gè)土樣進(jìn)行分離試驗(yàn)，以甲基硫菌靈為唯一碳源，只能生長(zhǎng)出1個(gè)菌的土樣所占數(shù)量最多，其次1個(gè)菌都不能長(zhǎng)的土樣所占的比例也比較大。

2.2 甲基硫菌靈降解菌液體培養(yǎng)篩選

甲基硫菌靈降解菌液體培養(yǎng)篩選結(jié)果表明，菌株降解率差異較大，對(duì)甲基硫菌靈降解率在80%以上的菌株共有20株，分別為T(mén)P157、TP350、TP206、TP382、TP427、TP381、TP389、TP439、TP329、TP441、TP415、TP416、TP426、TP402、TP208、TP163、TP254a、TP185、TP247、TP420（表2），可以用于后續(xù)試驗(yàn)，具有進(jìn)一步研究和應(yīng)用的價(jià)值。

在以甲基硫菌靈為唯一碳源下能夠生長(zhǎng)的451株菌中，其中413株菌的降解率在50%以下，所占比例高達(dá)91.6%;降解率在50%～90%之間的菌有30株，所占比例為6.7%;降解率在85%以上的菌有14株，所占比例僅為3.1%，其中有3株菌（TP157、TP206、TP350）的降解率在98%以上，降解能力極強(qiáng)。

2.3 甲基硫菌靈降解菌菌株的鑒定

通過(guò)16S rDNA序列聚類（圖1），可將37株甲基硫菌靈降解菌在0.1水平差異上分為5個(gè)類群，大多數(shù)菌集中在第1個(gè)類群中，含有24株細(xì)菌。TP228與其他菌株差異較大。運(yùn)用EZbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)，將所測(cè)菌株的16S rDNA序列與標(biāo)準(zhǔn)株序列進(jìn)行比對(duì)。分析表明，所測(cè)的37株菌歸屬于3門(mén)、4綱和5目（表3），總體上看，分離的菌株涉及11個(gè)屬、21個(gè)種細(xì)菌。有1株菌屬于放線菌門(mén)纖維菌屬，23株菌屬于壁厚菌門(mén)芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬下11種，13株菌屬于變形菌門(mén)蒼白桿菌屬和耐寒短桿菌等9個(gè)屬（表3）。綜上所述，芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和蒼白桿菌屬占測(cè)試菌株的比例較大，為優(yōu)勢(shì)菌。

通過(guò)16S rDNA序列分析，室內(nèi)篩選中獲得的甲基硫菌靈降解率在98%以上的菌株有TP157、TP206、TP350，其中TP157屬于假單胞菌屬，TP206和TP350都屬于蒼白桿菌屬，三者都屬于變形菌門(mén)。

2.4 甲基硫菌靈降解菌的溫室篩選

噴施室內(nèi)篩選的20株高效降解甲基硫菌靈菌株14 d后，未處理的對(duì)照中可檢測(cè)出大量的甲基硫菌靈殘留，而經(jīng)降解菌株處理后，除TP106處理的煙葉中農(nóng)藥殘留量與對(duì)照無(wú)明顯差異，TP179煙葉中農(nóng)藥殘留量高于對(duì)照外，其他18株菌處理的樣品中的農(nóng)藥殘留量均有不同程度的降低，降解率范圍在 6.29%～52.40%，其中TP185、TP382、TP208、TP389、TP420和TP243等6株菌溫室降解甲基硫菌靈的降解率在40%以上，TP185和TP382降解菌甲基硫菌靈降解率在50%以上。

2.5 甲基硫菌靈降解菌田間篩選試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，田間煙草施用甲基硫菌靈降解菌14 d后，參試的20株細(xì)菌均有降解農(nóng)藥的效果，降低幅度為14.45%～91.84%。TP179、TP350、TP106、TP382、TP405、TP381、TP254、TP242、TP206、TP163、TP416、TP208、TP243、TP185、TP247等15株細(xì)菌的田間降解率大于50%，其中TP247、TP185、TP243、TP208、TP416等5株菌降解效果較好，降解率分別為91.84%、90.34%、89.54%、87.33%、85.50%，具有大面積應(yīng)用推廣潛力，須研究其生物安全性和應(yīng)用前景（表5）。

3 結(jié)論與討論

甲基硫菌靈是一種廣譜性內(nèi)吸低毒殺菌劑，具有內(nèi)吸、預(yù)防和治療作用，在煙草生產(chǎn)中常用于真菌類病害的防治。由于其具有內(nèi)吸性，并在煙株體內(nèi)轉(zhuǎn)化成多菌靈[9]，因此更容易形成殘留。本研究中未測(cè)定煙葉中多菌靈的含量，無(wú)論對(duì)空白對(duì)照還是試驗(yàn)處理均只測(cè)定煙葉上甲基硫菌靈的殘留量，具有可比性，可將篩選出的菌株應(yīng)用于減少土壤中甲基硫菌靈的殘留。此外，本研究采集的云南省各州（市）煙區(qū)噴灑過(guò)甲基硫菌靈的土壤中所含降解甲基硫菌靈的菌株較少，這可能是由于甲基硫菌靈降解速度緩慢，易于富集，在煙葉和土壤中殘留量較大，研發(fā)有效的甲基硫菌靈降解微生物制劑用于減少該農(nóng)藥殘留具有廣闊的應(yīng)用前景。

土壤中的微生物具有種類多、變異快、適應(yīng)強(qiáng)等特點(diǎn)，是生物修復(fù)的重要資源。細(xì)菌由于具有適應(yīng)能力強(qiáng)、易誘變的特點(diǎn)，在農(nóng)藥降解中占據(jù)著重要的地位。目前，已分離出來(lái)的能降解農(nóng)藥的細(xì)菌主要有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬等[10-13]，本研究通過(guò)田間篩選出的降解率高于85%的菌株有TP247、TP185、TP243、TP208和TP416，分別屬于克雷伯菌屬、短小桿菌屬、蒼白桿菌屬、固氮螺菌屬和芽孢桿菌，除芽孢桿菌屬和蒼白桿菌屬之外[14]，其他3個(gè)屬鮮有報(bào)道。

在液態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下，TP157、TP350和TP206菌株降解甲基硫菌靈的能力較強(qiáng)，降解效率均在98%以上，在溫室條件下，其降解率均降低至35%以下，在田間條件下，其降解率分別為14.45%、55.84%、78.61%。說(shuō)明降解菌生長(zhǎng)繁殖和對(duì)靶標(biāo)農(nóng)藥的降解受到環(huán)境因素（如溫度、濕度、光照等）的影響較大。深入研究農(nóng)藥降解菌菌株的降解特性、研發(fā)適合菌株施用的劑型，將極大地提升菌株降解農(nóng)藥殘留的能力。如何將篩選出的高效甲基硫菌靈降解菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)有待于進(jìn)一步研究。

在自然界中存在著豐富的能夠降解甲基硫菌靈的微生物。用梯度稀釋法分離篩選出451株農(nóng)藥降解菌株。通過(guò)搖瓶培養(yǎng)和高效液相色譜法復(fù)篩得到降解效率在80%以上的20株菌株。然后通過(guò)田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參試的20株細(xì)菌均有降解甲基硫菌靈的效果，降低幅度為14.45%～91.84%。其中TP247、TP185、TP243、TP208、TP416等5株菌降解效果較好，降解率分別為91.84%、90.34%、89.54%、87.33%、85.50%，可作為甲基硫菌靈降解菌生物制劑的備選菌株。

參考文獻(xiàn)：

[1]李義強(qiáng)，周楊全，徐金麗，等. 煙葉中多菌靈農(nóng)藥殘留的降解規(guī)律和影響因素[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2017，23（4）：40-49.

[2]王津軍，文國(guó)松，丁金玲，等. 煙草農(nóng)藥殘留研究進(jìn)展及降低煙葉農(nóng)藥殘留的探討[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（3）：329-332.

[3]陳少華，羅建軍，林慶勝，等. 農(nóng)藥殘留降解方法研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：343-345.

[4]尤民生，劉 新. 農(nóng)藥污染的生物降解與生物修復(fù)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（1）：73-77.

[5]李曉飛，夏振遠(yuǎn)，雷麗萍，等. 福美雙農(nóng)藥降解菌的分離與篩選[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35（1）：137-142.

[6]Omenn G S，Colwell R R. Environmental biotechnology：reducing risks from environmental chemicals through biotechnology[M]. New York：Plenum Press，1988：505.

[7]王銀善，龐學(xué)民. 農(nóng)藥甲胺磷的微生物降解[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，1985，5（3）：315-321.

[8]李玉梅，王根林，于洪久，等. 土壤農(nóng)藥殘留微生物降解研究進(jìn)展[J]. 北方園藝，2007（4）：72-74.

[9]田麗梅，向 明，耿永勤. 前處理方法對(duì)煙草中多菌靈和甲基硫菌靈殘留測(cè)定的影響[J]. 廣州化工，2017，45（22）：102-103.

[10]亓文靜. 有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選、分離鑒定及其降解動(dòng)力學(xué)特性研究[D]. 蘭州：蘭州理工大學(xué)，2007：6-12.

[11]劉玉煥，鐘英長(zhǎng). 甲胺磷降解真菌的研究[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1999：19（2）：172-175.

[12]張金萍. 微生物降解農(nóng)藥殘留技術(shù)研究[J]. 種子科技，2017（3）：84-85.

[13]儀美芹，王開(kāi)運(yùn)，姜興印，等. 微生物降解農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，33（4）：519-524.

[14]柏文琴，李 梅，邱星輝，等. 蒼白桿菌B2對(duì)甲基對(duì)硫磷降解途徑研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，6（4）：48-54.