交泰丸含藥血清對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L的影響*

邢作英，王永霞，朱明軍，陳召起，宋歡歡，高 原，胡宇才，陳 鵬，鄭 佳

（1．河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心，鄭州 450000；2．河南省人民醫(yī)院宣傳處，鄭州 450000）

交泰丸首見于明代《韓氏醫(yī)通》，清代王士雄《四科簡效方》，始出交泰丸方名，標(biāo)明黃連和肉桂用量10∶1，用藥以黃連為主。目前在臨床主要應(yīng)用于病機(jī)為心火亢盛，心腎不交之心悸。心律失常多歸屬于中醫(yī)的“心悸”、“怔忡”等范疇，是心臟電活動(dòng)失常的表現(xiàn)。早期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)交泰丸對(duì)室性早搏及多種原因引起的快速性心律失常有效。司曉晨等[1]研究發(fā)現(xiàn)：黃連的提取物黃連素可以保護(hù)心肌細(xì)胞膜，阻斷Ca2+超負(fù)荷所觸發(fā)的遲后除極，從而消除觸發(fā)活動(dòng)所致的心律失常。鈣通道是心肌細(xì)胞維持動(dòng)作電位平臺(tái)期的主要電流，同時(shí)為其他離子流活動(dòng)和心肌細(xì)胞的不應(yīng)期提供適合的電位條件[2]。但是交泰丸能否通過調(diào)控L-型鈣離子電流調(diào)節(jié)心肌電活動(dòng)，從而影響心率發(fā)揮抗心律失常作用少有報(bào)導(dǎo)。因此，本實(shí)驗(yàn)利用血清藥理學(xué)及膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從離子通道水平研究交泰丸對(duì)單個(gè)豚鼠心室肌細(xì)胞鈣離子電流及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，探討其治療心律失常的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，8～12周，250～350 g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2010-0001；成年豚鼠，10～12 周，雌雄兼用，250～350 g，清潔級(jí)，由北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0004，動(dòng)物倫理審批號(hào)：YFYDW2013008。

1.2 儀器 倒置顯微鏡（日本Olympus IX71），放大器（Heka，EPC-10），三維操縱儀（Sutter），軟件（PatchMaster，德國 Heka公司），GraphPad Prism 5，Igor，玻璃微電極及其他手術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)器械。

1.3 溶液和試劑 根據(jù)參考文獻(xiàn)，溶液和試劑如下：Buffer A緩沖液，Buffe B緩沖液，25℃下調(diào)pH 值至 7．3～7．4。心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，鈣通道細(xì)胞外液25 ℃下 pH 值調(diào)至 7．2[3-4]。

1.4 血清制備和分組 中藥復(fù)方具有其獨(dú)特的物質(zhì)基礎(chǔ)，與單味藥及其簡單加和在化學(xué)成分上可能有區(qū)別[5]，所以按照《四科簡效方》交泰丸原方比例黃連：肉桂（10∶1）配伍，取黃連（江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20130725）100 g，肉桂（江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20130512）10 g合并煎煮為交泰丸組。另取黃連100 g，肉桂10 g分別煎煮制備黃連組和肉桂組，黃連煎液和肉桂煎液以1∶1比例混合為黃連加肉桂組，各藥量分別為成人的5倍劑量，以1 mL/100 g（體質(zhì)量）的劑量灌胃給予大鼠，每日2次，空白組給予等容積生理鹽水。連續(xù)給藥3 d，末次給藥1 h后戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，采血離心收集血清。分別制得空白、黃連、肉桂、黃連加肉桂和交泰丸含藥血清，在制備的心肌細(xì)胞液中分別加入10%和15%濃度相應(yīng)血清放于37℃，5%CO2的孵育箱中孵育24 h后，選取完整、立體、橫紋清晰的細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.5 豚鼠心室肌細(xì)胞分離 改裝Langendorff灌流裝置[6-8]，出口溫度調(diào)為37℃，出口滴速調(diào)為3～4 mL/min。乙醇50 mL，去離子水400 mL，Buffer A 50 mL，Buffer B 100 mL，其中50 mL盛放于10 cm小皿中置于4℃冰箱中備用。KB液150 mL，酶液50 mL均通以100%氧氣持續(xù)飽和30 min以上。Buffer B（約20 mL）封口單向灌流沖管，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉豚鼠，迅速游離并取出心臟，放入4℃Buffer B中，游離主動(dòng)脈，逆行插管連于灌流裝置上，行Langendorff灌流。先用Buffer B逆向灌流心臟1～3 min，后改為Buffer A灌流1～3 min，最后以酶液灌流，灌流器內(nèi)進(jìn)液約10 mL后酶液循環(huán)灌流消化心臟。約20 min后取下心臟用眼科剪將心室肌組織剪成盡量小的組織塊盛于KB液中，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分離，獲得單個(gè)心室肌細(xì)胞。用200目的細(xì)濾網(wǎng)過濾含有心肌細(xì)胞的KB液，過濾后的細(xì)胞液用小燒杯定容至30 mL備用。

1.6 全細(xì)胞膜片鉗記錄 實(shí)驗(yàn)在室溫（20～25℃）下進(jìn)行[9-10]，細(xì)胞孵育24 h后取出，加入鈣通道細(xì)胞外液，同時(shí)配合使用鈣通道電極內(nèi)液。顯微鏡下選取外形完整，形狀規(guī)則，橫紋清晰的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。拉制玻璃微電極充灌好電極內(nèi)液吸引封接心肌細(xì)胞，形成高阻封接（Giga seal），注射器負(fù)壓吸引破膜，進(jìn)行電容補(bǔ)償。補(bǔ)償完成后給予相應(yīng)的電信號(hào)刺激，進(jìn)行信號(hào)采集。激活曲線給予-70 mV鉗位電壓，從-60 mV開始階躍刺激，以10 mV為間隔階躍至60 mV，每次階躍電壓持續(xù)250 ms；失活曲線給予-70 mV鉗位電壓，從-60 mV開始階躍刺激，以10 mV為間隔階躍至40 mV，每次階躍電壓持續(xù)1 000 ms，每次階躍電壓后給以250 ms的10 mV鉗位電壓；失活后恢復(fù)曲線給予-70 mV鉗位電壓，給以 10mV 電壓，持續(xù) 250ms，后間隔（1、2、4、8、16……2 048 ms）再次給以持續(xù)250 ms的10 mV電壓，記錄ICa-L失活后恢復(fù)曲線。信號(hào)經(jīng)四階貝塞爾的低通濾波器，截止頻率為1 kHz，采樣頻率為10 kHz。記錄ICa-L激活電流、失活電流和恢復(fù)電流，分析得到激活、失活和失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS 20．0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s）表示，給藥后各組間進(jìn)行比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組電流密度變化 10%濃度黃連組、肉桂組、黃連加肉桂組和交泰丸組各組ICa-L峰值電流密度（pA/pF）與空白組比較抑制率分別為：50．3%（P＜0．05）；25．5%（P＞0．05）；15．2%（P＞0．05）；57．5%（P＜0．05）。15%濃度各組與空白組比較抑制率分別為：27．5%（P＞0．05）；4．9%（P＞0．05）；47．9%（P＜0．05）；54．5%（P＜0．05）。其中與空白組比較抑制率最大的是10%濃度交泰丸組，抑制率為57．5%。見表1、圖1。

表1 各組ICa-L電流密度比較s，pA/pF）Tab.1 Comparison of ICa-L current density of each groups,pA/pF)

表1 各組ICa-L電流密度比較s，pA/pF）Tab.1 Comparison of ICa-L current density of each groups,pA/pF)

注：與空白組比較，*P＜0．05。

?

圖1 各組ICa-L抑制率Fig.1 Inhibition rates ICa-L of each group

2.2 激活和失活時(shí)間常數(shù)變化 10%和15%濃度各組的激活時(shí)間常數(shù)和失活時(shí)間常數(shù)分別如表2所示。與空白組比較：10%濃度肉桂組的快失活時(shí)間常數(shù)變化率最大（P＜0．05）；15%濃度組激活時(shí)間常數(shù)肉桂組和交泰丸組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），黃連組和黃連加肉桂組與肉桂組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；15%濃度組快失活時(shí)間常數(shù)肉桂組和交泰丸組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），黃連組與肉桂組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；15%濃度組慢失活時(shí)間常數(shù)各組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；藥物使鈣離子通道激活和失活減慢，激活和失活時(shí)間延長。各組恢復(fù)時(shí)間常數(shù)分別如表2所示，其中與空白組比較，15%濃度各組失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；藥物使鈣離子通道失活后恢復(fù)時(shí)間延長，通道恢復(fù)減慢。

表2 各組豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L激活、失活時(shí)間常數(shù)和失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)比較

表2 各組豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L激活、失活時(shí)間常數(shù)和失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)比較

注：與空白組比較，*P＜0．05；與黃連組比較，#P＜0．05；與肉桂組比較，△P＜0．05。

?

3 討論

中醫(yī)藥以其悠久的歷史，確切的療效，在臨床應(yīng)用治療心律失常方面有良好的療效[11-14]。復(fù)方與單味藥及其簡單加和在化學(xué)成分上有區(qū)別，在為數(shù)眾多的化學(xué)成分中，究竟那些是有效成分，哪些是無效成分，哪些是起主要作用的成分等尚未可知。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)分組中不僅觀察了黃連組、肉桂組和交泰丸組的作用差異，也觀察了兩藥機(jī)械加和后的黃連加肉桂組的藥理作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黃連加肉桂組和交泰丸組對(duì)各指標(biāo)的影響差異并不十分顯著，可見兩種煎藥方式對(duì)藥效影響不明顯。

預(yù)實(shí)驗(yàn)確定血清藥濃度為10%和15%，這兩個(gè)濃度可以較好地檢測(cè)藥物對(duì)鈣通道的藥效作用，并且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。但是，在記錄鈣通道電流的過程中，各組藥物對(duì)鈣電流的抑制率并不全部呈現(xiàn)出劑量依賴性，10%濃度的交泰丸組抑制率最大為57．5%，可能是實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生了細(xì)胞毒性的原因。同時(shí)結(jié)果顯示，在藥物對(duì)鈣通道的作用中，復(fù)方交泰丸的藥效并非總是最好的，肉桂含藥血清使鈣通道的激活和失活時(shí)間常數(shù)及失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)變化最顯著，說明中藥復(fù)方及其拆方的藥效存在差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：交泰丸各組分藥物抑制鈣離子電流，延長鈣通道的激活和失活時(shí)間常數(shù)，使失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)均不同程度延長，藥物對(duì)鈣通道動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響可能導(dǎo)致了鈣電流減小。鈣離子通道阻滯劑（CCB）[15-16]主要集中應(yīng)用于快速性心律失常中。CCB通過降低自律細(xì)胞動(dòng)作電位4相坡度而降低自律性[17]，減少0期除極速度及幅度而抑制傳導(dǎo)。對(duì)于房撲房顫患者能夠減慢心室率，促進(jìn)轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律。交泰丸各組分含藥血清可以抑制鈣離子電流，其作用與鈣離子阻滯劑作用機(jī)制相同，提示交泰丸可能在防治心律失常的過程中通過抑制鈣離子通道電流，降低了細(xì)胞自律性，抑制傳導(dǎo)，延長細(xì)胞動(dòng)作電位以延長心肌有效不應(yīng)期，促進(jìn)竇性心律的轉(zhuǎn)復(fù)，從而發(fā)揮抗心律失常的作用，這可能是交泰丸具有抗心律失常作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究交泰丸對(duì)心肌細(xì)胞膜電位的影響，實(shí)驗(yàn)中排除了藥物本身離子成份的影響，精確反應(yīng)藥物非離子因素的藥理作用，以探討其抗心律失常的藥理機(jī)制。但是交泰丸對(duì)鈣通道相關(guān)蛋白影響和對(duì)整體動(dòng)物心律失常的影響仍需要進(jìn)一步研究。