槲皮黃酮改善心肌細(xì)胞肥大過程中對(duì)線粒體功能及動(dòng)力學(xué)的影響

吳 舜 ，陳明君 ，周 燕

（1．武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430400；2．武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430400）

隨著對(duì)心臟疾病研究的不斷深入，心肌細(xì)胞能量代謝紊亂及凋亡的研究已成為當(dāng)前熱點(diǎn)。心肌細(xì)胞能量代謝的主要場(chǎng)所在線粒體，而且細(xì)胞凋亡的起始也發(fā)生在該細(xì)胞器[1]。線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致心力衰竭（心衰）的發(fā)生發(fā)展，因此改善線粒體功能是治療心衰的重要環(huán)節(jié)[2]。線粒體功能障礙及其動(dòng)力學(xué)失衡是心肌肥厚發(fā)生的重要誘導(dǎo)因素[3]，因?yàn)榫€粒體在心肌細(xì)胞能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用。槲皮黃酮是黃酮類活性物質(zhì)，表現(xiàn)出抗氧化、抗炎癥及參與免疫調(diào)節(jié)等方面的作用[4-5]。除此之外，槲皮黃酮還可以改善線粒體功能障礙、降低氧化應(yīng)激損傷，具有保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷的作用[6]。本研究中采用血管緊張素II（AngII）誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞肥大，觀察槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞能量代謝紊亂的保護(hù)作用及其對(duì)線粒體功能障礙、穩(wěn)定線粒體動(dòng)力學(xué)平衡的影響。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠（1～3 d）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（京）2006-0009。

1.2 主要試劑及儀器 槲皮黃酮（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100357-201603），DMEM培養(yǎng)基、II型膠原酶、FBS（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Hyclone公司），AngII（美國Sigma公司），CCK8試劑盒（Ameresc公司），BCA試劑盒（上海碧云天公司），三磷酸腺苷（ATP）試劑盒、JC-1試劑盒（英國Abcam公司），兔抗鼠視神經(jīng)萎縮蛋白（OPA1）、動(dòng)力相關(guān)蛋白 1（Drp1）、磷酸化動(dòng)力相關(guān)蛋白（p-Drp1）及 βactin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（武漢谷歌生物公司）。Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀（DX540，美國），DYCZ-24DN型電泳儀（北京六一儀器廠，中國），4000B倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（Leica，德國），HERA cell CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國），自動(dòng)X光片機(jī)UPV凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-It/EC3）。

1.3 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 原代心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定參考文獻(xiàn)[7]，將心肌組織消化為單細(xì)胞懸液后，差速離心分離加入含20%FBS及0．1mmol/L5-溴脫氧尿嘧啶的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至第4天進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定，采用SABC法，細(xì)胞首先用大鼠α-橫紋肌動(dòng)蛋白抗體孵育，DAB顯色后，陽性為α-心肌肌動(dòng)蛋白。

1.4 藥物干預(yù)濃度篩選 參照多篇研究文獻(xiàn)，初步確定 AngII濃度分別為 1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L，槲皮黃酮濃度為 5、10、20 μmol/L，分別處理心肌細(xì)胞48、72 h后采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總含量，采用CCK8試劑盒分析藥物對(duì)細(xì)胞的毒性，每組實(shí)驗(yàn)做4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。將確定的最佳藥物濃度用于后續(xù)研究。

1.5 心肌細(xì)胞蛋白濃度及細(xì)胞直徑測(cè)定 使用1×10-5mol/L濃度AngII和10 μmol/L槲皮黃酮干預(yù)心肌細(xì)胞48、72 h后，采用倒置顯微鏡觀察、拍照及測(cè)量細(xì)胞直徑，并采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總含量，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。

1.6 ATP含量測(cè)定 將6孔板細(xì)胞用AngII、槲皮黃酮干預(yù) 72 h 后裂解細(xì)胞，4 ℃ 、1．2×104r/min 離心12 min取上清。在96孔板中加入100 μL ATP檢測(cè)工作液，室溫放置5 min。再加入50 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻。采用酶標(biāo)儀測(cè)定RLU值。

1.7 活性氧（ROS）水平測(cè)定 細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)72 h后，采用10 μmol/L DCFH-DA溶液重懸，37℃細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 min。每3～5 min顛倒一下，讓探針與細(xì)胞充分接觸。用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后用200 μL磷酸緩沖鹽（PBS）溶液重懸，采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定。其中激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

1.8 線粒體膜電位（MMP）測(cè)定 具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行熒光法測(cè)定。熒光顯微鏡濾波器激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，散發(fā)波長(zhǎng)為590 nm，可見亮紅色熒光；激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，散發(fā)波長(zhǎng)為530 nm，可見綠色熒光。

1.9 蛋白表達(dá)測(cè)定 藥物干預(yù)細(xì)胞后，收集細(xì)胞裂解，采用BCA法測(cè)定蛋白總濃度后，每孔上樣50 μg蛋白進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)、封閉，然后將條帶放入含OPA1、Drp1及p-Drp1的抗體溶液中（稀釋比 1∶1 000），4℃振搖過夜，次日用HRP標(biāo)記二抗室溫反應(yīng)1．5 h后，TBST洗膜3次后ECL顯色，進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD法，方法不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngII濃度篩選 不同濃度AngII作用心肌細(xì)胞48、72 h后，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的吸光度OD值沒有明顯變化，說明AngII對(duì)心肌細(xì)胞沒有毒性作用。并且1×10-5mol/L濃度AngII對(duì)心肌細(xì)胞蛋白含量相對(duì)于空白組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；因此，1×10-5mol/L濃度AngII為本研究的有效干預(yù)劑量。見表1。

表1 不同濃度AngII對(duì)蛋白濃度的影響（Tab.1 Effects of varying concentrations of AngII on protein level（

表1 不同濃度AngII對(duì)蛋白濃度的影響（Tab.1 Effects of varying concentrations of AngII on protein level（

注：與空白組比較，*P＜0．05。

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2.2 槲皮黃酮濃度篩選 5、10、20 μmol/L槲皮黃酮與1×10-5mol/L濃度AngII共同作用心肌細(xì)胞48、72 h 后，10、20 μmol/L 槲皮黃酮可明顯降低心肌細(xì)胞中蛋白濃度，與模型組相比差異有顯著性（P＜0．05）；20 μmol/L 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞具有明顯的毒性作用，10 μmol/L槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞沒有明顯的毒性作用，因此，選用10 μmol/L槲皮黃酮、1×10-5mol/L AngII進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2。

表2 不同濃度槲皮黃酮對(duì)蛋白濃度的影響Tab.2 Effects of varying concentrations of quercetin on protein level

表2 不同濃度槲皮黃酮對(duì)蛋白濃度的影響Tab.2 Effects of varying concentrations of quercetin on protein level

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

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2.3 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響 與空白組比較，在48、72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組心肌細(xì)胞總蛋白濃度顯著升高（P＜0．05），心肌細(xì)胞直徑明顯增大（P＜0．05），提示心肌細(xì)胞肥大模型構(gòu)建成功。在上述時(shí)點(diǎn)槲皮黃酮組心肌細(xì)胞中蛋白濃度均顯著降低（P ＜0．05），而細(xì)胞直徑只在 72 h時(shí)顯著減小（P＜0．05），48 h時(shí)細(xì)胞直徑也有減小，但與模型組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0．05）。見表 3。

2.4 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞中ATP、ROS及MMP的影響 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了72 h時(shí)間點(diǎn)槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞中ATP、ROS及MMP的影響，見表4。模型組中ATP水平和線粒體膜電位MMP相對(duì)空白組明顯降低（P＜0．05），ROS 含量明顯增高（P ＜0．05）；槲皮黃酮處理心肌細(xì)胞72 h后，ATP水平和線粒體膜電位MMP明顯升高，ROS含量明顯降低（P ＜0．05）。見表 4。

表3 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞總蛋白含量及細(xì)胞直徑的影響Tab.3 Effects of quercetin on total protein content and cell diameter of cardiocytes

表3 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞總蛋白含量及細(xì)胞直徑的影響Tab.3 Effects of quercetin on total protein content and cell diameter of cardiocytes

注：與空白組比較，*P ＜0．05；與模型組比較，#P ＜0．05。

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表4 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞中ATP、ROS及MMP的影響Tab.4 Effects of quercetin on ATP,ROS and MMP in cardiocytes

表4 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞中ATP、ROS及MMP的影響Tab.4 Effects of quercetin on ATP,ROS and MMP in cardiocytes

注：與空白組比較，*P ＜0．05；與模型組比較，#P ＜0．05。

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2.5 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞中OPA1、Drp1及p-Drp1蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了72 h時(shí)間點(diǎn)槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞中OPA1、Drp1及p-Drp1蛋白表達(dá)的影響，見圖1。模型組中OPA1蛋白表達(dá)量顯著降低，而p-Drp1蛋白表達(dá)量顯著升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；槲皮黃酮處理心肌細(xì)胞72 h后，OPA1蛋白表達(dá)量顯著增高，而p-Drp1蛋白表達(dá)量顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0．05）。

3 討論

ROS是機(jī)體多個(gè)器官組織都存在的信號(hào)刺激子，ROS的堆積能導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化損傷，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡，然而線粒體是ROS產(chǎn)生的主要細(xì)胞器，線粒體功能狀態(tài)對(duì)保證細(xì)胞機(jī)能是否正常起著關(guān)鍵作用[8]。心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制并未完全得以解釋，而學(xué)者提出其與線粒體的功能密切相關(guān)，因?yàn)槟芰看x紊亂、氧化損傷及線粒體膜電位MMP降低都會(huì)引起心肌細(xì)胞肥厚。AngII屬于腎素血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，它能夠介導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS過多產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大及凋亡[9]。AngII能夠作用于NADPH氧化酶途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生進(jìn)而促使蛋白質(zhì)合成。AngII不直接引起心肌能量代謝障礙，而是誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌肥大及線粒體結(jié)構(gòu)、功能損傷。筆者采用1×10-5mol/L濃度AngII作用于心肌細(xì)胞48、72 h后，心肌細(xì)胞總蛋白濃度明顯升高、細(xì)胞直徑明顯增大，說明AngII可以很好地構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型。然而經(jīng)過10 μmol/L槲皮黃酮能夠改善心肌細(xì)胞肥大，表現(xiàn)在減少了細(xì)胞總蛋白濃度及細(xì)胞大小。AngII刺激心肌細(xì)胞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致線粒體功能損傷，ATP生成減少，AngII持續(xù)的刺激會(huì)導(dǎo)致線粒體ROS過度產(chǎn)生，后者進(jìn)而損傷氧化-還原的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)一步引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致膜內(nèi)外離子分布紊亂，引起線粒體膜電位MMP降低[10]。本研究發(fā)現(xiàn)1×10-5mol/L 濃度 AngII作用心肌細(xì)胞48、72h后，心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平及MMP顯著降低，并且ROS含量顯著升高，進(jìn)一步論證了前期報(bào)道結(jié)果。然而經(jīng)過槲皮黃酮處理心肌細(xì)胞72 h后，細(xì)胞內(nèi)ATP水平及MMP顯著升高，而且ROS含量顯著降低，說明槲皮黃酮可通過抑制ROS的產(chǎn)生從而改善線粒體的能量代謝。

圖1 槲皮黃酮對(duì)心肌細(xì)胞中OPA1、Drp1及p-Drp1蛋白表達(dá)的影響s，n=6）Fig.1 Effects of quercetin on expressions of OPA1,Drp1 and p-Drp1 in cardiocytess，n=6）

線粒體的融合-分裂由動(dòng)力蛋白相關(guān)的GTP蛋白酶精細(xì)調(diào)控，包括線粒體融合相關(guān)蛋白（Mfn）、線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1和線粒體分裂蛋白1，而Drp1在心肌細(xì)胞能量代謝及線粒體自噬中起著關(guān)鍵作用[11]。Drp1蛋白磷酸化可使該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體膜外，引起線粒體降解，導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化磷酸化水平降低，ATP合成異常，MMP下降，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[12]。本研究中AngII能誘導(dǎo)OPA1表達(dá)降低，Drp1蛋白磷酸化水平升高，進(jìn)而引起線粒體片段化，然而槲皮黃酮能夠改變上述蛋白表達(dá)的水平，進(jìn)而改善心肌細(xì)胞的肥大?？傊纹S酮對(duì)AngII引起的心肌細(xì)胞肥大具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低心肌細(xì)胞線粒體功能障礙、穩(wěn)定線粒體動(dòng)力學(xué)平衡相關(guān)。