雙波長HPLC同時測定八角蓮中4′-去甲基鬼臼毒素鬼臼毒素 槲皮素 山柰素的含量

鐘水生，顧炳仁，周堅，張華鋒，王亞瓊，郝剛

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215100)

八角蓮為小檗科植物八角蓮Dysosmaversipellis(Hance)M.Cheng ex Ying或六角蓮Dysosmapleiantha(Hance) Woods.等八角蓮屬多種植物的根或根莖，別名鬼臼，是我國傳統(tǒng)的民間常用藥之一，其已被多個地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)所收載，其中江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2016年版)收載的八角蓮為植物六角蓮Dysosmapleiantha(Hance) Woods的干燥根及根莖。具有清熱解毒、化痰散結(jié)、祛瘀消腫等功能。常用于癰腫療瘡、涼癰、咽喉腫痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，八角蓮還具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用[2]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對八角蓮中的化學(xué)成分進行了研究報道[3]，八角蓮中的化學(xué)成分主要為兩類，一類為木脂素類，其中以鬼臼毒素和4′-去甲基鬼臼毒素為代表，另一類成分為黃酮類成分，以槲皮素和山柰素為代表。藥理研究表明，鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素具有抗腫瘤作用，并展現(xiàn)出較強的抑制P388淋巴白血病細(xì)胞的作用[4]，而黃酮類成分槲皮素也被報道具有抗腫瘤、抗氧化、抗血栓、抗糖尿病及保護心血管和止瀉等方面的藥理作用[5]。

當(dāng)前，對八角蓮中木脂素類成分或黃酮類成分的測定均有報道[6-14]，但大多局限于單一類別有效成分的測定[6-9]。徐怡等[11]測定了八角蓮中槲皮素、山柰素和鬼臼毒素的含量，但其采用的檢測波長為鬼臼毒素的最大吸收波長290 nm，這一定程度上限制了八角蓮中低含量的黃酮類成分的檢測靈敏度。相關(guān)研究[12-14]分別采用高效液相色譜-二極管陣列-電化學(xué)聯(lián)用技術(shù)或超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定了八角蓮中活性成分含量，相較于高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)，該法并不適用于在眾多實驗室的普及。為增加靈敏度，并改善八角蓮中多組分質(zhì)量控制方法的普及性，本實驗以植物六角蓮來源的八角蓮藥材為研究對象，探索了采用HPLC雙波長法，對八角蓮中木脂素類代表成分鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素和黃酮類代表成分山柰素、槲皮素進行同時測定。經(jīng)驗證，該方法簡便、靈敏度高、重復(fù)性良好，適用于八角蓮中活性成分的同時測定，從而為完善八角蓮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters 2698型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、PDA紫外檢測器及Empower工作站。

1.2 試藥

對照品鬼臼毒素(批號：200602，純度100%)、4′-去甲基鬼臼毒素(批號：200901，純度：100%)、槲皮素(批號：201310，純度：93.2%)、山柰素(批號：201408，純度：99.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

八角蓮由蘇州市藥品檢驗檢測研究中心中藥室張華鋒主任鑒定為六角蓮Dysosmapleiantha(Hance)Woods的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

DIKMA C18Plus色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(50∶50)；檢測波長為290 nm(鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素)和360 nm(槲皮素、山柰素)；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min-1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含0.5、0.5、0.05、0.05 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取八角蓮粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，水浴回流1 h，放冷，再稱定重量，以40%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性

取2.2.1、2.2.2項下的溶液適量，按2.1項下色譜條件進行測定，結(jié)果如圖1。各色譜峰之間分離良好，相互之間不存在干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素和山柰素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為147.20、480.80、43.17、51.14 μg·mL-1的混合對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、5、8、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行測定，以各對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X，μg)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸計算，得回歸方程，4′-去甲基鬼臼毒素：Y=6.464 6×105X-250.5，r=0.999 4；鬼臼毒素：Y=5.998 7×105X-509.6，r=0.999 3；槲皮素：Y=4.012 3×106X-526.3，r=0.999 3；山柰素：Y=4.253 1×106X-624.5，r=0.999 2。

結(jié)果表明，4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰素分別在進樣量0.294 4～3.68、0.961 6～12.02、0.086 3～1.079 3、0.102 3～1.279 μg與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取2.2.1項下的混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件進行實驗，連續(xù)進樣6次，結(jié)果4個組分的RSD在0.5～0.7%，均小于2%，表明精密度良好。

注：A.混合對照品；B.八角蓮樣品。圖1 混合對照品和八角蓮樣品分別在290 nm和360 nm下的色譜圖

2.6 重復(fù)性試驗

取批號為20150817的八角蓮樣品6份，按2.2.2項下操作制得供試品溶液，并進行HPLC分析，計算所測4個組分的各自含量及RSD，結(jié)果所測組分的RSD分別為1.4%、0.9%、1.5%、1.6%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取批號為20150817的八角蓮樣品3份，按2.2.2項下操作制得供試品溶液，于室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h各進樣一次，考察4種組分各自峰面積的一致性，結(jié)果表明，各組分的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的批號為20150817的八角蓮樣品(含4′-去甲基鬼臼毒素為11.26 mg·g-1、鬼臼毒素為16.9 mg·g-1、槲皮素為1.76 mg·g-1，山柰素為2.40 mg·g-1)9份，每3份為一組(高、中、低)，每份0.25 g，各組中分別精密加入一定量的混合對照品溶液，混勻，揮干，按2.2.2項下操作，在2.1項下色譜條件進行分析，結(jié)果見表1。

表1 4個組分的回收率測定結(jié)果(n=9)

2.9 樣品測定

取4批八角蓮樣品，按2.2.2項下操作，制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件進行分析，并采用外標(biāo)法計算4個組分各自的含量，結(jié)果見表2

表2 八角蓮樣品中4個組分含量的測定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

對4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素和山柰素各自的對照品溶液分別進行紫外全掃描分析，結(jié)果顯示4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素的最大吸收波長在290 nm左右，而槲皮素、山柰素的最大吸收波長在360 nm左右。故初選290 nm和360 nm兩個波長分別作為木脂素類成分和黃酮類成分的檢測波長。取八角蓮供試品溶液，按初選波長在甲醇-0.1%磷酸溶液(50∶50)流動相條件下進行HPLC分析。結(jié)果290 nm的色譜圖顯示，在槲皮素的色譜峰位置處不光有槲皮素的色譜峰，也有一小未知峰，且未能實現(xiàn)基線分離，呈現(xiàn)肩峰，但在360 nm檢測波長時，槲皮素的色譜峰位處的峰形尖銳，未出現(xiàn)肩峰。后期進一步調(diào)試流動相比例，以使干擾峰與色譜峰達(dá)到分離，但分離后，樣品分析時間顯著延長，而對分離出的未知峰進行全掃描分析發(fā)現(xiàn)，該未知峰在360 nm處并無吸收，說明該未知共有峰在360 nm下并不影響槲皮素的定量，為縮短分析時間，故最終仍選用甲醇-0.1%磷酸溶液(50∶50)作為八角蓮中4個組分同時測定的流動相，此流動相既保證了未知共有峰不干擾定量的準(zhǔn)確性，又縮短了分析時間，增大了分析通量。

3.2 樣品制備方法的優(yōu)化

實驗中分別考察了甲醇、乙醇、甲醇水溶液、乙醇水溶液作為提取溶劑，超聲處理和回流提取兩種提取方式對各組分提取的影響，結(jié)果顯示，超聲處理和回流提取對木脂素類成分的提取回收率影響不大，簡單的超聲處理就能使木脂素類物質(zhì)提取完全。而對于黃酮類成分，采用簡單的超聲處理難以使它們提取完全，需采用相對劇烈的回流提取方式。經(jīng)過多次實驗，最終發(fā)現(xiàn)40%乙醇溶液的回流提取1 h能保證4個成分均能提取完全。故最終確定以40%乙醇為溶劑，回流提取1 h作為八角蓮的預(yù)處理方法。